搔刮损伤血管内膜法和球囊内皮剥脱法的操作和工具
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发布时间：2022-04-29 02:25
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时间：2022-06-28 16:22
1.1 混合血栓形成法 即取动物自身血自然凝固形成血栓。此法制作简单，且可根据需要制成合适大小和形状，以栓塞特定部位。如建立大鼠冠状动脉微栓塞模型〔1〕，取大鼠自身尾静脉血凝固成血栓，玻璃研磨器研磨5分钟，使之成为较均匀颗粒状悬液备用。大鼠麻醉后，取仰卧位，术区备皮消毒，气管插管，呼吸机辅助通气。取第2肋间水平横切口，剪断胸骨，切开心包，暴露主动脉根部， 钳夹升主动脉，同时使用直径0.5mm细针刺入主动脉根部注入血栓微粒，10s后松开钳夹的升主动脉，以栓塞微动脉。由于血栓来源自身，且富含血小板，纤维蛋白，红细胞等，符合冠脉微栓塞时病理生理改变。
1.2 白色血栓形成法 取动物自身血，常温下离心，后取上层血浆加入凝血酶，凝固成白色血栓。此血栓主要成分为纤维蛋白和血小板。人类缺血性脑梗死多为动脉粥样硬化斑块脱落形成的白色血栓栓塞所致，施海滨等〔2〕用介入技术建立犬急性脑栓塞模型适用于影像诊断和溶栓治疗的研究: 抽取犬自体静脉血，常温下以4000转/min离心10min后，取出上层血浆1ml，加入凝血酶100U混匀并注入尖端缩细的玻璃试管中(缩细部分内径1.0mm，长5cm)，凝固后取出，置入生理盐水中反复漂洗，剪成长为5～8mm的血栓条，再透视下将导管经股动脉插至颈内动脉，注入血栓条，即可形成脑栓塞。此法具有操作简单，创伤小，易存活，栓塞可靠的优点，可用于脑梗死的早期诊断及溶栓治疗研究。
2 体内血栓形成法
2.1 机械性损伤法 机械损伤血管内膜后，使内皮下细胞外基质裸露，促使血小板与胶原接触而被激活和黏附，启动凝血过程，导致血栓形成。根据机械损伤方法的不同又可再分为搔刮损伤血管内膜法〔3〕和球囊内皮剥脱法〔4〕通常采用家兔，麻醉后分离股动脉，然后用微型刮匙搔刮血管内膜或用球囊剥脱血管内皮，成功率达100%，操作简便易行。
2.2 电流损伤法 利用电刺激，破坏局部血管，使血管内膜损伤，促使血小板黏附聚集从而形成血栓。可根据需要建立冠状动脉，颈总动脉〔5〕，髂动脉〔6〕等部位的血栓形成模型。
2.1.1 冠状动脉内直流电刺激法 家犬分离冠状动脉左旋支，放入电磁流量仪探头记录血流量。于电磁流量仪探头远端将正电极穿过左旋支管壁作刺激电极，负电极缝在*皮下，以形成回路。用100uA直流电刺激300min〔7〕，即形成血栓。另外，血栓形成时，由于血流量的减少，冠状动脉血流会出现反应性的增加，而影响血栓的形成，为避免这种情况的发生，可在电极刺激部位放置一缩窄器〔8〕，此时刺激时间可大大缩短。
2.1.2 冠状动脉外直流电刺激法〔9〕家犬分离左冠状动脉前降支，剪一塑料片置于游离的冠状动脉下方，将双型刺激电极置于塑料片上，直流电0～5mA范围内可调，当刺激部位冠状动脉外膜呈黄褐色并失去弹性及远端冠脉充盈状态消失后既停止刺激。此方法和冠状动脉内直流电刺激法一样，所形成的血栓与人类动脉血栓形态结构类似，其主要成分为血小板，白细胞等。该方法是国内外常用的冠状动脉血栓形成方法。冠状动脉外电刺激比冠状动脉内电刺激法血栓形成耗时短，并保持了动脉管壁的完整，其关键是刺激电量的选择。
2.3 动脉异物法 动脉管腔狭窄形成湍流以及异物的诱导，均可激活血小板，使其黏附性和聚集性增加，血小板黏附于受损内膜下的胶原和异物，激活凝血途径形成血栓。犬麻醉后， 穿刺左颈总动脉，在导丝引导下，将固定有铜网圈的球囊送到左前降支中段，扩张球囊，将网圈固定在冠状动脉内膜上，退出球囊，即可诱发血栓形成。本法除直接影响血小板功能外，铜网圈的植入也可能诱发冠状动脉痉挛加速血栓形成，对研究抗冠状动脉血栓形成所致心肌梗死和药理学的研究及溶栓治疗是一种有价值的模型〔10〕。
2.4 结扎法 该法常用于制备下腔静脉血栓模型，静脉结扎后，引起局部血流淤滞，低氧，导致血管内皮损伤，启动凝血过程，而致静脉血栓形成。分离大鼠下腔静脉，结扎下腔静脉2～6h后于结扎线下方剖开管腔，取出血栓称重。犬手术显露双侧股静脉，在其近，远端分别结扎，持续48h，可造成犬股静脉血栓。该法所形成血栓为红色血栓，是简单易行的静脉血栓模型〔1112〕。
2.5 光化学法 本法系将光敏物质引入机体后在特定波长光线的照射下，发生光化学反应而产生单线态氧等活性氧，继而损伤血管内皮细胞，引起白细胞附壁，激发血小板黏附，聚集而形成血栓。光化学法诱导血栓形成常用的光敏物质有荧光素钠，血卟啉，二碘曙红，伊文思蓝等，用于照射的光源为单色绿光，滤去紫外光的汞灯，He-Ne激光等〔13〕。光化学法诱导肠系膜微循环栓塞时〔14〕， 由大鼠尾静脉注入血卟啉，10min后进行肠系膜微循环观察，选择直径为40～50um的细静脉，作为血栓形成的靶血管，用落射荧光显微镜100W汞灯作光源经紫外滤光片(波长为455nm)， 光斑直径为200um，照射在靶血管上以形成血栓。利用荧光显微镜自身配置的光源，照明简便，光照强度，照射区域的大小等易掌握，可控性强;梗塞形成过程与人类血管内血栓形成的病理过程相似。微血栓形成的全过程可直接通过显微镜进行观察，并可通过计算机图像采集系统读入，用计算机图像处理技术进行分析，定量计算血栓大小，对研究血栓形成过程及定量评价抗血小板聚集药物的效果是十分有用的。
2.6 化学药物致血栓形成法
2.6.1 月桂酸钠 其原理是利用化学物质损伤血管内膜，促进血小板黏附，聚集和促进血管活性物质的释放，形成闭塞性血栓。
2.6.1.1 月桂酸钠所致大脑微动脉血栓形成 大鼠麻醉后，分离一侧颈动脉系统，月桂酸盐分两次分别经颈外动脉及颈总动脉插管缓慢注入颈内动脉，造成大脑微动脉血管内皮损伤而致血栓形成。该模型无须开颅，创伤小，操作简便，因手术操作而导致的死亡率几乎为零，血管内皮的损害及紧接着血栓的梗阻都是有选择性的发生在MAC的一些小分支，MAC内皮无损伤或血栓形成，特异性较高，且大脑梗死范围及行为学改变较恒定，所形成血栓主要成分为纤维蛋白〔15〕。
2.6.1.2 月桂酸钠所致冠状动脉微血栓形成 大鼠麻醉后，气管切开，插管连接呼吸机，左前外侧中心切口进胸，分离主动脉并用血管夹夹闭主动脉后，迅速以微量注射器从心尖部直接向左心室注入月桂酸钠， 血管夹夹闭10s后松开，从而导致冠状动脉微血栓形成〔16〕。此法能很好的模拟由于内皮损伤，继发血小板粘附聚集以及炎症反应形成微血栓这一病理生理过程。
2.6.2 角叉菜胶致大鼠尾动脉血栓形成 大鼠皮下注射角叉菜胶，此后多数动物尾尖部在3～14出现暗红色血栓形成区，并逐渐向尾根部扩大，48～72经发绀变为黑色，随后干细脱落。该方法病理学检查可见病变区较大血管呈炎性改变伴有混合性血栓形成，血栓形成发生在尾部，界限明显，可从体表测量血栓形成的范围和程度，可利用该模型检测多种药物的抗栓效应。但需注意保证温度等实验条件的一致性。角叉菜胶常被用作致炎因子，它所诱发的大鼠尾动脉血栓形成与血管内炎症密切相关，此外角叉菜胶在体外能引起血小板聚集〔17〕。
2.6.3 氯化铁(FeCl3)致颈总动脉和血栓形成 大鼠麻醉后，暴露颈总动脉，将吸有FeCl3溶液的滤纸片包裹动脉〔28〕;或将吸有FeCl3溶液的小片定量滤纸敷在上，以损伤局部血管壁形成血栓〔29〕。该模型血栓的形成为混合性血栓，主要成分为血小板，红细胞和纤维蛋白。并且血栓形成部位固定，既可评价溶栓因子又可检验抗栓因子，为研究抗栓药物提供了较好的方法。
2.6.4 胰蛋白酶致颈总动脉血栓形成 家兔麻醉后分离一侧颈总动脉，用显微外科动脉夹夹住近心端和远心端，两端分别插入针头，经近心端针头用输液泵匀速灌注胰蛋白酶，随后以相同速度灌注0.9%氯化钠溶液冲洗，灌注液经远心端排出该模型所致血栓富含血小板和纤维蛋白，类似于临床血栓形成〔20〕。
2.6.5 高分子右旋糖苷致DIC形成 高分子右旋糖酐具有高粘，高聚作用，使血粘度高，血细胞聚集增多，导致微血栓形成。微血栓动物模型的复制采用10%高分子右旋糖酐。可引起心脏，肠系膜的微栓塞及弥散性血管内凝血〔21〕。
3 弥散性血管内凝血模型的建立
3.1 兔脑粉悬液复制弥散性血管内凝血 兔脑浸液的制备:将家兔放血处死，去处兔脑，去净附着的血管和脑膜，用自来水缓缓冲洗后再用纱布及滤纸吸干，置研钵中加入丙酮，将脑组织研磨压碎，后将丙酮倒净或过滤，反复更换丙酮，研磨6～7次，以去处水分及脂肪，直至脑质被捣成灰白色颗粒为止，最后将脑组织平铺再滤纸上，置37℃温箱中半小时，待丙酮蒸发，脑组织成粉末状。用生理盐水配制成2%兔脑粉悬液后从兔耳缘静脉注入，形成DIC模型〔22〕。其原理是兔脑悬液富含组织因子，经静脉注入后启动外源性凝血途径，从而导致DIC的发生〔23〕。
3.2 凝血酶建立兔急性弥散性血管内凝血 方法采用凝血酶和氨基己酸静脉滴注造成家兔急性模型。 氨基己酸能够抑制网状内皮系统对于凝血酶等活化了的凝血因子的消除作用，所以在造模中加用氨基己酸可辅助凝血酶造成体内血栓形成。用此种方法建立的DIC模型，用时短，效果明显，成功率高〔24〕。
3.3 内毒素致DIC 内毒素通过损伤血管内皮，激活巨噬细胞，单核细胞而释放组织因子，启动凝血过程，形成DIC。用内毒素直接静脉注射或小鼠腹腔注射即可形成DIC模型〔25〕，该法简单快捷，是目前常用的建立DIC模型的方法。
通过制作动物模型，人们进行新的治疗筛选和评估，为人类攻克血栓性疾病和DIC打下了坚实的实验基础。上述血栓形成及弥散性血管内凝血的造模方法和原理各异，应用时应根据不同的目的而选用合适的方法。
