请教关于荧光共振能量转移（FRET）中的标记方法有哪些？请不要给我讲FRET技术。
发布网友
发布时间：2022-04-27 06:29
共2个回答
热心网友
时间：2023-10-04 14:17
下面给出几个例子：
二、FRET技术的应用
随着生命科学研究的不断深入，对各种生命现象发生的机制，特别是对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用的研究变得尤为重要。而要想在这些方面的研究取得重大突破，技术进步又是必不可少的。一些传统的研究方法不断发展，为蛋白质-蛋白质间相互作用的研究提供了极为有利的条件，但同时这些研究手段也存在不少缺陷：如酵母双杂交、磷酸化抗体、免疫荧光、放射性标记等方法应用的前提都是要破碎细胞或对细胞造成损伤，无法做到在活细胞生理条件下实时的对细胞内蛋白质-蛋白质间相互作用进行动态研究。FRET技术的应用结合基因工程等技术正好弥补了这一缺陷，下面是FRET技术在相关生命科学领域中的具体应用。
1、检测酶活性变化
（1）活细胞内检测蛋白激酶活性
蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志，研究其中的酶活性是研究信号通路的一个重要方面。以前酶活性测定主要是利用放射性以及免疫化学发光等方法，但前提都是要破碎细胞，用细胞提取物测定酶活性，还无法做到活细胞内定时、定量、定位的观测酶活性变化。而利用FRET方法就可以很好的解决这个问题：如zhang等人利用FRET原理设计了一种新的探针（一种融合蛋白）：新探针包含一个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域，一个与磷酸化底物结构域相结合的磷酸化识别结构域。这个探针蛋白的两端是GFP的衍生物CFP与YFP，利用FRET原理工作。当底物结构域被磷酸化后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折叠，两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移。如果磷酸酶进行作用将其去磷酸化，分子就会发生可逆性的变化。该研究小组[3-4]用几组嵌合体来研究四种已知蛋白激酶的活性：PKA（protein kinase A）、Src、Abl 、 EGFR（epidermal growth factor receptor）。他们将构建的报导探针转入细胞，根据FRET来检测激酶活性变化。对细胞进行生长因子处理后，几种酪氨酸激酶都在几分钟内被激活，检测到25%-35%的活性变化。用forskolin激活PKA能增强FRET 25%-50%的变化，激酶在整个细胞质范围内被激活。如果将报导探针加上核定位信号使之定位于核中，则FRET变化被极大的延迟了，这也说明了PKA作用的区域性。由此可见，利用FRET方法可以很好的观察活细胞内酶活性变化，并且能做到定时、定量、定位，是一种非常有效的研究手段。
（2）关于细胞凋亡的研究
细胞凋亡过程大致可以分为三个不同的阶段：起始期—细胞通过不同途径接受多种与凋亡有关的信号；整合期—多种信号在此整合，细胞做出生存或死亡的决定；执行期—一旦做出死亡的决定，即将进入一个不可逆转的程序。天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate-specific protease，Caspase）在细胞凋亡的执行期发挥关键作用，近年来对其研究成为细胞凋亡领域的一个热点。而FRET技术的出现对此的研究提供了更为有利的条件：Reiko Onuki等人利用FRET技术研究了Caspase8与Bid蛋白之间的相互作用，Caspase8活化后作用Bid蛋白，使其裂解成两个片段，然后羧基片段转移到线粒体使其释放细胞色素C诱发细胞凋亡。研究者将Bid蛋白两端分别与CFP与YFP融合，精心设计使其在没有被裂解前刚好可以发生FRET，当Bid蛋白被裂解后FRET效应自然消失。所以是一种很好的检测Caspase8酶活性方法，而且当Bid蛋白与CFP与YFP融合之后仍能行使正常的功能，当融合物在细胞内被裂解后，连接CFP的片段转移到线粒体，通过CFP荧光可以很清楚的观测到其在细胞内的定位。另外Markus Rehm[6]与 Kiwamu Takemoto[7]等人利用FRET技术设计了可以反映Caspase3酶活性变化的融合报告蛋白,通过此报告蛋白证实了在细胞凋亡过程中Caspase3酶活性变化是一个非常迅速的过程。
2、关于膜蛋白的研究
（1）受体激活效应在细胞膜上的横向扩散
膜蛋白的研究一直都是信号通路研究中的重点和难点。当细胞膜局部受外界刺激后，相应受体被激活然后向细胞内传导信号，可是在这之前是否会有细胞膜上的横向效应呢？近来Peter等人[8]在Science上报道：细胞膜局部受刺激后，膜受体活化效应可迅速扩展到整个细胞膜。他们将膜受体EGFR（epidermal growth factor receptor）与GFP融合，抗活化后的EGFR抗体用Cy3染料标记，刺激因子EGF（epidermal growth factor）用Cy5染料标记，这样可以很明显的看到EGF在细胞膜上的局部分布。当EGF作用细胞后，EGFR活化并与其抗体结合，于是GFP与Cy3染料充分接近发生FRET，利用此方法可以很明显的观测到细胞膜局部受刺激后，受体活化效应迅速扩散到整个细胞膜。
（2）膜蛋白的定位修饰
我们知道膜蛋白是定位在细胞膜上不同的亚区域中，例如脂质筏（lipid rafts）和小窝（caveolae），小窝包含着丰富胆固醇、鞘磷脂和信号蛋白。那么这些蛋白怎样到达它们的目的地呢？Zacharias等在Science上报道，酰基化足以使这些蛋白定位在脂质筏。他们的研究是通过FRET（fluorescence resonance energy transfer）技术，用GFP的突变体CFP（cyan fluorescent protein）和YFP（yellow fluorescent protein）来进行。因为这些蛋白并没有细胞内定位序列，所以研究者将各种酰基化修饰的敏感序列加在这些蛋白上，研究它们在细胞膜上的分布。因为分布的微结构域非常小，所以当CFP和YFP共分布在同一个微结构域时，就可以用FRET来观测到。研究者最初是用激酶Lyn的酰基化序列加在这些荧光蛋白上，使myristoyl和palmitoyl侧链链接在CFP和YFP的氨基端。结果发现产生的FRET信号非常强，用能去除胆固醇而使小窝和脂质筏消失的MCD（5-methyl-β-cyclodextrin）处理也不能使荧光消失，所以这说明荧光蛋白已经非常牢固的结合在了一起。然后研究者用荷电的基团代替荧光蛋白上疏水的基团时，发现聚体形成被抑制了。
3、细胞膜受体之间相互作用
外界刺激因素向细胞内的信号传递一般认为通过其在胞膜上的受体，当配体与受体结合后，引起受体构象变化或化学修饰，介导信号传递。但是最近关于Fas及其同源物TNFR(均为胞膜上的三聚体受体)的研究发现：它们都可以在无配体存在的情况下自发组装，并介导信号传递，引发细胞凋亡。其中在鉴定Fas发生三聚体化的实验中使用了FRET技术：将Fas分别与CFP与YFP融合，利用此项技术可以很方便的观测到Fas单体是否发生聚合。Yogesh Patel等人研究两种递质多巴胺与抑生长素。发现SSTR5（the type 5 somatostatin receptor）与D2R（type 2 dopamine receptor）共同分布在大鼠脑中的一些神经元中，他们将两者共表达，发现加入多巴胺能的激活剂能增强SSTR5与somatostatin的亲和性，加入多巴胺拮抗剂能抑制SSTR5的信号传递，表达D2R能恢复SSTR5突变体与腺苷环化酶的偶联。这不由是人们想到：两种受体之间是否存在某种联系呢？终于，应用FRET技术（SSTR5用红色染料标记，D2R用绿色染料标记）发现了两者之间的直接相互作用。而且当两受体的配体都存在时才出现FRET，说明两受体被激活时才发生相互作用。
4、细胞内分子之间相互作用
Rho家族的小G蛋白通过调节肌动蛋白的多聚化*着重要的生理功能，象其他信号分子一样，这些GTPase的效应在时间和空间上都非常集中，那么如何检测它们活性的时空动力学呢? Klaus Hahn等在Science上报道了一种新的技术FLAIR（fluorescence activation indicator for Rho proteins）可很好的解决这个问题：他们将PAK1的能结合并激活Rac-GTP的domain PDB与荧光染料Alexa标记，微注射入表达GFP与Rac融合蛋白的细胞中。这样，当Rac与PDB相互作用时，GFP和Alexa就会足够接近以致发生FRET。这种方法能够实时的检测到在一个活的细胞中Rac的定位改变与Rac激活之间的关系。
Matsuda 等人在Nature上报道关于细胞内Ras和Rap1激活，也是用了FRET技术：他们将Ras和Raf的Ras结合结构域（Raf RBD）与GFP的突变种YFP和CFP进行融合构建。他们将Ras和YFP融合，RafRBD与CFP融合，当两分子靠的足够近时，它们之间就会激发FRET，设计的蛋白Raichu-Ras，Raichu代表和Ras结合的嵌合单元。当把Raichu-Ras与特异性的GEFs（guanine-nucleotide exchange factors）和GAPs（GTPase-activating proteins）共表达，清楚的显示FRET的增加和减少与Ras突变体的激活和抑制有关。此外他们还用同样原理观测了Rap1激活。追问写了。
参考资料：http://liu3305602.blog.163.com/blog/static/148546532007527192542/
热心网友
时间：2023-10-04 14:18
kinEASE属于直接法，用稀有金属Eu标记抗体 抗体与底物磷酸化位点结合 Eu与XL665之间发生FRET 检测两个波长的荧光值再进行分析
Transcreener ADP和cAMP属于间接法(竞争法)，抗体可以与ADP/cAMP结合，也可以与ADP-d2/cAMP-d2结合，两者形成竞争关系。Eu与d2之间发生FRET，检测双波长荧光值进行分析。
类似的还有LANCE试剂盒
