双抗夹心ELISa的步骤是什么?
发布网友
发布时间：2022-04-29 22:09
共5个回答
热心网友
时间：2022-06-24 03:32
本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
（2）单抗包被-抗原-二抗-酶标二抗-底物显色。(改良双抗体夹心法)
本法首先是将特异性抗体a包被于固相载体，经洗涤加入含有欲测抗原之待检样品。经孵育洗涤后再加一次未标记的特异性抗体b，而这次加入的抗体b于第一次包被于固相载体上的特异性抗体a对被测抗原来说都是特异性的，但不是用同种动物免疫制备的，否则可出现非特异性反应。经孵育洗涤后，再加酶标记抗b抗体，再经孵育洗涤后加底物显色进行测定。这种方法与双抗体夹心法不同之处是多加了一层抗体。因此，放大的倍数更高，故比双抗体夹心法更加灵敏。同时避免标记特异性抗体，而另一优点是只要标记一种抗抗体，即可达到多种应用。
热心网友
时间：2022-06-24 03:33
1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照):
将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度，每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体，(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中)。
2.PBS洗3次，每次3分钟。
具体为：吸干或甩干孔内反应液；用洗涤液过洗一遍（将洗涤液注板孔后，即甩去）；浸泡，即将洗涤液注满板孔，放置1-2分钟，间歇摇动，浸泡时间不可随意缩短；吸干孔内液体，可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；重复操作涤3次。
3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度):
检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl。将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品至少加双孔，每孔100μl，置于37℃,40-60min。
4 .PBS洗3次，每次3分钟。
5. 加入酶标抗体:
酶标抗体:根据酶结合物提供商提供的参考稀释度进行或建立浓度梯度，37℃30-60min之间，短于30min往往结果不稳定，每孔加100μl。
6 .PBS洗3次，每次3分钟。
7. 加入底物液(现用现配):
TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml无水乙醇) 0.5ml底物缓冲液(PH5.5)10ml0.75％H2O232μl，底物加入量每孔100μl（TMB空白显色孔除外）,置37℃避光放置20-25分钟。
8. 终止反应:
每孔加入终止液50μl(2M H2SO4)终止反应, 此时蓝色立转*，于20min内测实验结果。
9.结果判断:
可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅。也可测吸光值：在ELISA检测仪上，TMB反应产物检测需要450nm波长，检测时一定要首先进行空白孔系统调零。用测定标本孔的吸收值与一组阴性标本测定孔平均值的比值(P/N)表示，当P/N大于2时作为抗体的效价即大于阴性对照吸光值的2倍，(数值的大小依具体检测要求而定)。
热心网友
时间：2022-06-24 03:33
至于是单抗或者多抗都可以。
如果是酶标二抗（二抗就是抗抗体）的话，一般是包被抗原-抗体-酶标二抗，这种是间接法的
热心网友
时间：2022-06-24 03:34
热心网友
时间：2022-06-24 03:35
