如何稳定敲低特定的miRNA
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发布时间：2022-04-30 01:23
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时间：2022-06-27 23:09
然而，
Peng Jin（埃默里大学）
我们使用RNA oligo和载体的方法。对于RNA oligo方法，我们采用类似siRNA双链的miRNA,及anti-miRNA来增加或阻断特定miRNA的活性。这种方法便于操控细胞培养中特定miRNA的活性。
载体方法有着长期改变的优势，能够追踪个别细胞。我们利用人工的shRNA质粒或Pol II表达载体，来过表达特定的miRNA.对于miRNA的下调，我们要么表达一个shRNA,它能产生与miRNA前体的茎环结构互补的siRNA,要么使用miRNA海绵（miRNA sponge），它能在特定miRNA的多个目标位点表达报告基因。
Winston Kuo（哈佛大学）
目前有两种通用策略：1） 基于载体或病毒的miRNA或miRNA反义链序列的过表达；2） 外源miRNA双链或反义抑制剂的转染。方法的选择取决于实验的设计。
一般说来，我们倾向于外源试剂的转染。载体/病毒的策略还依赖Drosha/Dicer酶对转录本的顺序加工，且必须通过Exportin 5从核中输出。在人类癌细胞系中曾报道过Drosha和Dicer水平的miRNA加工缺陷。此外，Exportin 5也被认为是细胞和小鼠模型中miRNA生物发生途径的瓶颈。外源过表达可饱和Exportin 5,从而胜过内源小RNA序列。极端的情况下会引起细胞或动物死亡。外源双链转染后，直接进入RISC复合物中，因而绕过了这些陷阱。
当然，在需要持久的功能获得或功能丧失时，还需要载体或病毒的稳定表达。稳定的细胞系必须小心地建立，采用病毒滴度测定来避免上述问题。
Joshua Mendell（约翰霍普金斯大学）
对于miRNA的上调，我们常常构建表达载体。制备起来非常简单。我们只是扩增miRNA发夹结构及一些侧翼序列，并直接克隆PCR产物。有时候，我们也用合成的miRNA模拟物来瞬时转染细胞，以过表达miRNA.
为了抑制miRNA,我们一般使用市场上的反义寡核苷酸。我们使用Dharmacon和Exiqon的抑制剂都获得了成功。这些试剂的局限在于它们只能瞬时作用。为了实现稳定抑制，我们开始用所谓的miRNA海绵。它们实际上是有着多个miRNA结合位点的捕获转录本，能隔离细胞中有活性的miRNA.
Silvia Monticelli（瑞士生物医学研究所）
我们主要使用慢病毒或反转录病毒系统，因为我们主要研究原代细胞，而且需要长时间的持续表达。取决于细胞类型，我们也使用lipofectamine或Amaxa来瞬时转染。对于下调，我们正使用miRNA海绵。对于短期研究，miRNA抑制剂的瞬时转染效果也很好。
Galina Gabriely（哈佛大学）
为了评估处理后miRNA的活性，我们测定了与miRNA结合位点融合的萤光素酶的表达。不过，评估miRNA活性的最佳方法是评估它的天然靶点的表达（如果miRNA靶点已知）。这可以通过western blot分析来进行。miRNA表达的调节可用northern blot分析来评估miRNA的表达水平。在某些情况下，定量RT-PCR也能给出miRNA表达的可靠结果，但miRNA调节所使用的寡核苷酸会在PCR反应中干扰引物，从而影响真实的表达数据。
Winston Kuo（哈佛大学）
我们使用几种策略，包括miRNA qPCR,miRNA northern blot,萤光素酶报告分析，mRNA靶点的qPCR,以及蛋白靶点的western blot.在上面我已经讨论了miRNA qPCR和northern blotting.这些能够直接检测miRNA过表达或下调。萤光素酶报告分析包括3'-UTR序列克隆在萤光素酶编码序列的下游。这些3'-UTR包含了人工的miRNA同源位点或已验证mRNA靶点的内源序列。后一个策略中的关键对照是生成假定同源位点上种子序列的点突变。这些点突变将使miRNA不能调节萤光素酶的表达。
Joshua Mendell（约翰霍普金斯大学）
为了验证miRNA上调，我们还是使用northern blotting或实时定量PCR来测定miRNA的丰度。测定miRNA的抑制就没那么简单。反义oligo确实降低了miRNA的丰度。因此，你也可以用同样的方法来监控miRNA抑制。不过，体内miRNA的隔离不会总是让miRNA丰度下降。另一个方法是用报告基因重组子来监控miRNA的抑制。miRNA会抑制报告基因的表达，除非它的活性受阻。当然，这种报告基因的使用一般受限于细胞培养环境。
Silvia Monticelli（瑞士生物医学研究所）
这些实验中的关键一步是：通过转染或转导细胞，你有效地改变了它们，因此你的确需要很多对照，来确认你所看到的结果是来自miRNA的表达或下调。这对miRNA尤其重要，因为在很多情况下，你并不期待一个强的表型，但是你在寻找微调基因表达的温和效果。我想你至少需要目的miRNA之外的miRNA和种子区域的突变体。我还推荐使用不同方法来设法获得相同的结果。
