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pcr技术的原理是什么?

发布网友 发布时间:2022-04-22 13:43

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热心网友 时间:2023-10-16 08:34

PCR技术的基本原理类似于DNA天然复制的一个过程,pcr技术的特异性主要是依赖于与靶序列的寡核苷酸引物。PCR技术其实是一种体外的DNA 产生扩增的技术,是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下,依赖于DNA聚合酶的酶促合反应,将需要被扩增的DN*段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经过一系列反应的多次循环,然后使DNA的片段在数量上可以增加,从而就可以在较短的时间内获得我们所需的特定的基因片段。

扩展资料:

Pcr技术具有特异性强、灵敏度高、简便快速、纯度要求低等特点。PCR产物的生成量是以指数方式增加的,PCR的灵敏度可达3个RFU;在细菌学中最小检出率为3个细菌。PCR反应用耐高温的聚合酶,一般在2-4 小时就可以完成扩增反应。而且不需要分离病毒或者是细菌及培养细胞等过程,DNA的粗制品以及RNA均可以作为扩增的模板。而且可直接用临床的标本如血液、洗嗽液、毛发、活组织等DNA的扩增检测。

热心网友 时间:2023-10-16 08:34

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成:

①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;

②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;

③引物的延伸:DNA模板-引物结合物在72℃、DNA聚合酶(如TaqDNA聚合酶)的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”。

而且这种新链又可成为下次循环的模板,每完成一个循环需2~4分钟,2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。



扩展资料:

模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要,建议加热时间参考试剂说明书,一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

循环中一般95℃,30秒足以使各种靶DNA序列完全变性,可能的情况下可缩短该步骤时间。变性时间过长损害酶活性,过短靶序列变性不彻底,易造成扩增失败。

退火温度需要从多方面去决定,一般根据引物的Tm值为参考,根据扩增的长度适当下调作为退火温度。然后在此次实验基础上做出预估。退火温度对PCR的特异性有较大影响。

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