蛋白质纯化技术的方法有哪几种?
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发布时间：2022-04-23 02:20
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时间：2023-10-11 12:36
在克隆基因表达产物的检测分析过程中，电泳是常用的方法，但在纯化蛋白时，通常都不采用电泳的方法。由于某些特殊的目的，需要用聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化蛋白质，常用下述方法进行：①从电泳后的凝胶上切下所需的相应条带，将凝胶压碎，用缓冲液浸泡，使其中的蛋白质扩散出来，从而获得纯化的蛋白质。此法简单但回收率低。②将电泳后的凝胶用电洗脱的方法使蛋白质从凝胶转移到溶液中，从而达到纯化的目的。此法快速，回收率高，但需要特殊的电泳装置。
二、色谱法：
色谱法（chromatography）是蛋白纯化中最常用的一种方法，这种方法既可以制备大量的纯化蛋白质，又可以保持蛋白质的生物学活性。色谱的种类很多，可分为常规色谱和高效液相色谱（high-performance liquid chromatography,HPLC）。凝胶过滤色谱、离子交换色谱、亲和色谱等均为常规色谱法。HPLC包括反相高效液相色谱（reversed-phase HPLC,RP-HPLC）、离子交换高效液相色谱（ion exchange HPLC）等。根据目标蛋白性质的不同可选用相应的色谱分离技术纯化蛋白质。
1.凝胶过滤色谱法
凝胶过滤色谱法（gel-filtration chromatography, GFC）又称排阻色谱。凝胶是一类具有三维空间结构的多孔网状颗粒物质，如琼脂糖凝胶（sepharose）、葡聚糖凝胶（sephadex），将凝胶颗粒装入色谱柱中即可用于物质的分离。当被分离物质通过凝胶柱时，大于凝胶孔径的分子不能进入凝胶内部，只能在凝胶颗粒之间的空隙中流动和分配，流经的路途短，可很快被洗脱出来，而小于凝胶孔径的分子则进入凝胶颗粒内部，在凝胶内部穿行，流经的路程长，移动的速度慢，最后被洗脱出来；分别收集不同时相的洗脱液，即可得到纯化的物质。
GFC可在存在有多种离子、去污剂、尿素、盐酸胍、高或低离子强度、常温或低温等多种条件下进行，根据所分离物质的性质不同可选择相应的色谱条件，从而获得有生物学活性的纯化的生物大分子。
2.离子交换色谱法
离子交换色谱法（ion exchange chromatography,IEC）是根据物质的酸碱度、极性和分子大小的不同进行分离的技术，通常包括吸附、吸收、扩散、穿透、静电引力等复杂的物理化学过程。自然界的包括蛋白质在内的生物大分子都带有电荷，当所需分离的物质通过离子交换色谱柱时，由于所带电荷、分子量等不同，有些被固定相靠静电引力所吸附，未被吸附的物质可被缓冲液首先洗脱出来；被吸附的物质由于所带电荷多少不同，对固定相的亲和力大小也不同，可被梯度离子缓冲液先后洗脱下来，使同一溶液中的不同物质被分离。色谱柱中填充的阴离子交换剂可用于带正电荷物质的分离，而阳离子交换剂可用于带负电荷物质的分离。
3.亲和色谱法
许多生物大分子物质具有与其结构相对应的专一分子发生可逆性结合的特征，如酶与底物及辅助因子、酶与抑制剂、抗原与抗体、激素与受体、核酸片段与其互补的核酸序列、生物素与亲合素等，分子间的这种结合能力叫作亲和力。
亲和色谱（affinity chromatography）是利用生物大分子间所具有的特异性亲和能力进行分离的方法。该方法常把可亲和的一对分子中的一方固定在不溶于水的化合物上作为色谱的支持体即载体，使之固相化，作为固定相；另一方随流动相流经固定相，双方即可发生特异性结合；用流动相经过一段时间的洗涤，可将杂质去除，而后再利用亲和吸附的可逆特性，改用特殊的流动相使所需分离的物质被解离下来，从而得到纯化的物质。亲和色谱法中的载体种类很多，最常用的是琼脂糖凝胶（sepharose），其分子上有较多的羟基，活化后可与亲和分子相耦联，另外其理化性质稳定，不会影响色谱的分离过程。
亲和色谱法可在温和条件下操作，纯化过程简单、快速、分辨率高，对分离含量极少且性质不稳定的生物活性物质极为有效。但由于不是任何生物大分子之间均有特异的亲和力，而针对于某一种亲和分子就需要制备专一的亲和色谱柱，因此亲和色谱的应用具有一定的局限性，主要由于蛋白质尤其是酶、抗原、抗体的分离与纯化。
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时间：2023-10-11 12:36
热心网友
时间：2023-10-11 12:37
主要步骤：
第一步富集：如果是有标签的蛋白，一般用亲和色谱（affinity chromatography）是利用生物大分子间所具有的特异性亲和能力进行富集，然后用咪唑洗脱。要是没有标签的，基本是先超滤浓缩，然后再通过盐析的方式去富集。
第二步初级分离：主要是利用离子交换色谱法，是通过蛋白表面电荷来分离。楼上的说的很清楚。
第三步精细纯化：主要通过分子筛，通过蛋白空间结构和分子量不同来达到分离效果。
