在开展无菌实验之前要对无菌室进行怎样的无菌处理
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发布时间：2022-04-22 08:24
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时间：2022-06-18 14:14
综述：无菌室的无菌处理：先进行无菌室空间的消毒，开启紫外灯30-60分钟。检验用的有关器材， 搬入无菌室前必须分别进会灭菌消毒。
无菌试验室主要用于微生物学、生物医学、生物化学、动物实验、基因重组以及生物制品等研究使用的实验室统称洁净实验室-生物安全实验室。
特点：
凭借对用户需求的深刻理解，精湛的咨询顾问和工程设计施工方面的专家队伍，先进的规划运营理念和与国际著名品牌供应商的良好合作关系，形成了一套完善的洁净实验室-生物安全实验室解决方案。它具有高安全性、专业化、整体性、模块化、标准化等特点。
参考资料来源：百度百科－无菌试验室
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时间：2022-06-18 14:14
1、微生物检验的准备工作
1.2操作前的准备:
1.2.1无菌室使用前必须打开无菌室的紫外灯辐照灭菌30分钟以上，并且同时打开超净台进行吹风。以保证无菌室的洁净度符合要求。
1.2.2微生物检验玻璃仪器的清洗
1.2.2.1按技术要求将各种玻璃仪器进行清洗，可用瓶刷或海绵沾上肥皂或洗衣粉或去污粉等洗涤剂刷洗，然后用自来水充分冲洗干净。热的肥皂水去污能力更强，可有效地洗去器皿上的油污。洗衣粉和去污粉较难冲洗干净而常在器壁上附有一层微小粒子，故要用水多次甚至10次以上充分冲洗，或可用稀盐酸摇洗一次，再用水冲洗，然后倒置于磁盘或木架上，在室内晾干，放烘箱烘干。
1.2.2.2玻璃器皿经洗涤后，若内壁的水是均匀分布成一薄层，表示油垢完全洗净，若挂有水珠，则还需用洗涤液浸泡数小时，然后再用自来水充分冲洗。
1.2.2.3装有固体培养基的器皿应先将其弃去，然后洗涤。带菌的器皿在洗涤前先浸在2％煤酚皂溶液（来苏尔）或0.25％新洁尔灭消毒液内24小时或煮沸半小时，再用上法洗涤。带病原菌的培养物最好先行高压蒸汽灭菌，然后将培养物倒去，再进行洗涤。
1.2.2.4盛放一般培养基用的器皿经上法洗涤后，即可使用，若需精确配制化学药品，或做科研用的精确实验，要求自来水冲洗干净后，再用蒸馏水淋洗三次，晾干或烘干后备用。
1.2.2.5准备好所用的各种试剂，做好普通营养琼脂或其他选择的培养基。
1.3消毒、灭菌
微生物检验用器材及场所必须进行灭菌或消毒处理，不同的对象采用不同的处理方法。
1.3.1． 高压蒸汽灭菌:工作服、口罩、稀释液等，置高压杀菌锅内，一般采用121℃灭菌半小时,当然不同的培养基有不同的要求,应分别处理
1.3.2． 火焰灭菌： 接种针、接种环等可直接火焰灭菌
1.3.3． 高温干燥灭菌： 各种玻璃器皿、注射器、吸管等，置于燥箱中160℃灭菌2小时 。
1.3.4．一 般消毒:无菌室内的凳、工作台、试管架、天平、待检物容器或包装均无法
进行灭菌，必须用其他方法进行消毒处理，采用2%石炭酸或来苏儿水溶液擦拭消毒，工作人员的手也用此法进行消毒。
1.3.5． 空气的消毒： 开启紫外灯照射30―60分钟即可。
2、培养基的配制、验证及存储
培养基制备的质量将直接影响微生物生长。由于各种微生物对其营养要求不完全相同，培养目的的不同，各种培养基制备要求如下。
2.1．根据培养基配方的成分按量称取，然后溶于蒸馏水中，在使用前对应用的试剂药品应进行质量检验。
2.2．PH测定及调节：PH测定要在培养基冷至室温时进行，因在热或冷的情况下，其PH有一定差异，当测定好时，按计算量加进碱或酸混匀后，应再测试一次。培养基PH值一定要正确，否则会影响微生物的生长或影响结果的观察。但需留意因高压灭菌可影响一些培养基的PH降低或升高，故不宜灭菌压力过高或次数太多，以免影响培养基的质量，指示剂、往氧胆酸钠、琼脂等一般在调完PH后再加进。
2.3．培养基需保持澄清，便于观察细菌的生长情况，培养基加热煮沸后，可用脱脂棉花或绒布过滤，以除往沉淀物，必要时可用鸡蛋白澄清处理，所用琼脂条要预先洗净晾干后使用，避免因琼脂含杂质而影响透明度。
2.4．培养基的灭菌既要达到完全灭菌目的，又要留意不因加热而降低其营养价值，一般121℃15min即可，如为含有不耐高热物质的培养基如糖类、血清、明胶等，则应采用低温灭菌或间歇法灭菌，一些不能加热的试剂如亚碲酸钾、卵黄、TTC、抗菌素等，待基础琼脂高压灭菌后凉至50℃左右再加进。
2.5．每批培养基制备好后，应做无菌生长试验及所检菌株生长试验。假如是生化培养基，使用标准菌株接种培养，观察生化反应结果，应呈正常反应，培养基不应贮存过久，必要时可置4℃冰箱存放。
2.6．目前各种干燥培养基较多，每批需用标准菌株进行生长试验或生化反应观察，各种培养基用相应菌株生长试验良好后方可应用，新购进的或存放过久的干燥培养基，在配制时也应测PH，使用时需根据产品说明书用量和方法进行。
2.7．每批制备的培养基所用化学试剂、灭菌情况及菌株生长试验结果、制作职员等应做好记录，以备查询。
3、样品的采集：接到第一检查站通知后，提前30分钟到达生产现场，双方确认生产品种、下辊时间后相互签字后，检验员用75%酒精棉球擦手两次，用灭菌刀取样，放到事先灭好菌的纸袋中，带回放入无菌室中待检，并做好标识。
4、样品的微生物检验
4.1化验员进入无菌室前，必须用肥皂或消毒液洗手消毒，然后在缓冲间更换专用工作服，鞋，帽子，口罩和手套(或用75%的乙醇再次擦拭双手)，方可进入无菌室进行操作。
4.2供试品在检查前，应保持外包装完整，不得开启，以防污染。检查前，用70％的酒精棉球消毒外表面。
4.3检查酒精等内酒精体积是否在2/3处，不足时先加好无水酒精，擦干净洒在瓶外的酒精方可点燃酒精灯。
4.4用75%的后酒精再次擦拭消毒双手，用镊子取出酒精棉球点燃，在待检样瓶口和稀释水瓶口处环绕几圈对瓶口灭菌。
4.5纸样的预处理：用无菌剪剪开信封，无菌镊子取出样品，用同样的方法将样品剪成5mm×5mm左右的方块，放在天平台上的灭菌纸上，称取样品无菌操作将样品置于灭菌生理盐水中，摇动10分钟，使纸样充分湿润，完全浸泡在无菌生理盐水中，注意不可用力过猛，小心样液溅出。
4.5如果样品所含细菌较多需稀释时，应以无菌方法吸取1ml样液注入盛有9ml灭菌生理盐水中，吸上来在轻吹下去往复2-3次混匀成1:10稀释液，吸取1:10稀释液1ml注入盛有9ml灭菌生理盐水中混匀成1：0:1稀释液，如此递增西施一次，必须更换一支灭菌吸管。
4.6打开培养皿灭菌桶，取出所需的培养的培养皿并在培养皿上做好标识。
4.7吸取液体样品前，灭菌吸管在使用前下端需通过火焰灭菌（再火焰上来回灼烧三次以上）稍冷再用。
4.7移取样品前应充分混匀，再用灭菌吸管吸取1ml注入做好标识的培养皿中。
4.8每个培养皿中倒入冷却至约45℃的培养基15-20ml，立即平摇培养皿，时代测样品能够均匀分散于培养基中。
4.9样品检验过程中所用方法、出现的现象和结果等均要用文字做好纪录，以作为对结果分析、判定的依据，记录要求具体、清楚、真实、客观、不得涂改和伪造。
4.10工作完毕，将酒精灯帽扣上，两手应用肥皂或洗手液洗净，必要时先用2%消毒液消毒，然后用水冲洗。如果菌也洒在桌面或地面上，应立即用5%石碳酸溶液或3%的来苏尔倾覆在被污染处至少30分钟，再做处理。
5、培养
培养基冷却后，翻转培养基，使培养皿底在下面，放入37℃培养箱中培养。
6、样品的留存：
纸样做好标识留存48小时以上，已备待查。检验完毕的培养基放在冰箱中留存48小时以上以备待查。
7、无菌检验出现异常数据时：
站长在日常巡视时，发现异常时及时对生产盐水、培养基，操作空白进行排查，立即组织复测，当检验员发现菌落异常时，立即汇报给站长，进行排查，组织复检。
8、废弃物处置
8.1处置程序
8.1.1检验后的废气物必须随时清除，并及时送到指定地点加以处理。检验后的废弃样品，若对环境无害，可做为垃圾处置。
8.1.2液体废物一般可加漂白粉进行氯化消毒处理。固体可燃性废物分类收集、处理、一律及时焚烧。固体非可燃性废物分类收集，可加漂白粉进行氯化消毒处理。满足消毒条件后作最终处置。
8.1.3.若经过物理、化学方法处理后能转化为无害的或达到排放标准的有害废弃物，在经过妥善处理后，克排放处理。
8.1.4一次性使用的制品如手套、帽子、工作物、口罩等使用后放入污物袋内集中烧毁。
8.1.5. 应有盛装废弃物的容器，最好是防碎裂的，里面盛装适宜的消毒液，消毒液使用时新鲜配制。把消毒液及废弃物倒入一个容器里以备高压灭菌。盛装废弃物的罐子在再次使用前应高压并洗净。可重复利用的玻璃器材如玻片、吸管、玻瓶等可以用1000-3000mg/L有效氯溶液浸泡2-6h.然后清洗重新使用，或者废弃。
8.1.6. 用来盛放的容器应用消毒液浸泡；严格与感染性生物材料区分，防止二者混放；过期的生物性试剂应废弃，禁止使用。盛标本的玻璃、塑料、搪瓷容器可煮沸15min.或者用1000mg/L有效氯漂白粉澄清液浸泡2-6h，消毒后用洗涤剂及流水刷洗、沥干；用于微生物培养的，用压力蒸汽灭菌后使用。
8.1.7. 微生物检验接种培养过的琼脂平板应压力灭菌30min，趁热将琼脂倒弃处理。
8.2处置规定
8.2.1、检验过程中产生的任何污染材料未经消毒不能拿出实验室。
8.2.2、液体废弃物必须收集在防漏、未破的容器内，经高浓度化学消毒剂处理。
8.2.3、对剩余标本、接触过的培养基、菌种等丢弃前均须适当消毒。
8.2.4、对于任何有污染的锐器如针头、注射器、玻璃等在处理前不要用手接触。
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时间：2022-06-18 14:15
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1、先进行无菌室空间的消毒，开启紫外灯30-60分钟。
2、检验用的有关器材， 搬入无菌室前必须分别进会灭菌消毒。
3、操作人员必须将手清洗消毒，穿戴好无菌工作衣、帽和鞋，才能进入无菌室。
4、进入无菌室后再一次消毒手部，然后才进行检验操作。
5、无菌室应保持清洁整齐，室内仅存放必须的检验用具如酒精灯、酒精棉、火柴、镊子、接种针、接种环、玻璃铅笔等，不要放与检测无关的物品。
6、室内检验用具及凳桌等保持固定位置，不随便移动。
7、每2-3周用2%石炭酸水溶液擦拭工作台、门、窗、桌、椅及地面，然后用3%石炭酸水溶液喷雾消毒空气，最后紫外灯杀菌半小时。
8、定期检查室内空气无菌状况，细菌数应控制在10个以下，发现不符合要求时应立即彻底消毒灭菌。
9、无菌室杀菌前应将所有物品置于操作之部位（待检物例外），然后打开紫外灯杀菌30分钟，时间一到，关闭紫外灯待用。
无菌室无菌程度的测定方法：取普通肉汤琼脂平板、改良马丁培养基平板各3个（平板直径均9厘米），置无菌室各工作位置上，开盖曝露半小时，然后倒置进行培养，测细菌总数应置37℃温箱培养48小时；测霉菌数则应置27℃温箱培养5天。细菌、霉菌总数均不得超过10个。
