细胞冻在-80冻和液氮冻的区别
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发布时间：2023-01-03 20:11
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时间：2023-10-12 06:44
细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使细胞生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术，它一般包括复苏、传代及冻存，这里增添了驯化的步骤，主要是为了得到我们需要的目标细胞，如将贴壁细胞驯化为可悬浮培养的悬浮细胞等。
通常情况下细胞实验周期较长，所以总免不了要冻存一部分细胞以备后用，那我就来说下冻存时的操作步骤和注意细节:
细胞冻存
1、为什么要进行细胞冻存？
细胞培养过程会出现污染或者有些细胞经长期传代培养后可能被诱导分化，而这时之前冻存的细胞就是重新来过的“火种”，避免全军覆没的危险；同时细胞冻存还能节省实验室空间、经费及时间成本；最重要的是确保实验的一致性和连贯性。
2、保护剂的分类？
目前，细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞外形成冰晶会因为脱水使局部电解质浓度增高，pH值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱；如细胞内冰晶形成较多会造成细胞核DNA空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死亡。
图 有无细胞外冰晶形成（左：有；右：无）
因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。在细胞冻存的过程中用来保护细胞而添加的保护剂一般分为渗透型如甘油、二甲基亚砜（DMSO）或甲醇等，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内冰晶的形成，从而减少对细胞的损伤。另一种是非渗透型的保护剂剂，一般是些大分子物质，主要包括聚乙.烯吡.咯烷酮（PVP）、蔗糖等，可保护细胞免受伤害，提高细胞活率。
3、细胞冻存要什么？
超低温冰箱或液氮罐
0.25%胰蛋白酶
20%以上血清的完全培养液或血清
DMSO(分析纯)或无色新鲜甘油(121℃蒸气高压消毒)
专用细胞冻存管，程序降温盒
吸管、离心管、喷灯、冻存管架
4、细胞冻存怎么做？
图 细胞冻存
细胞收集
贴壁细胞：选择处于对数生长期的细胞，将培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。去掉胰蛋白酶后加入适量培养基终止消化。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液后离心。
悬浮细胞：直接将细胞收集到离心管后离心
保护剂添加
去上清，加入含20%以上小牛血清的完全培养基或血清，于4℃预冷15分钟后，加入10%的DMSO，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，分装于细胞冻存管，细胞浓度为3×10^6～1×10^7cells/ml之间。将装有细胞悬液的冻存管盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记。
细胞冻存
细胞冻存一般是慢冻：先将冻存管置入置于4℃ 30-40 min，再转入-20℃ 2h后，再放入-80℃冰箱冷冻过夜后保存到液氮罐中。
图 Genever冻存管及程序降温盒
目前更多使用程序降温盒，将细胞冻存管放于盒内，直接置于超低温冰箱，程序降温盒可控制每分钟下降1℃。
1.拧开冻存盒；2.抽出支架；3.加入异丙醇；4.支架放回冻存盒中；5.放入冻存管；6.拧好盖子放入-80℃冰箱保存4h。
05、渗透型保护剂的配置
冻存液常规配比为培养基：血清：DMSO=7:2:1，如果细胞比较珍贵，可以调整为血清：DMSO=9:1。
无血清细胞冻存液如Corning KM Banker II，属于即用型细胞液可直接冻存于-80℃冰箱而无需程序性降温。无血清细胞冻存液不含血清，只含DMSO、葡萄糖等营养成份，大大降低了动物血清来源病毒、霉菌和支原体等污染的风险，且冻存液成分和配比明确，批次间差异很小，能够保证生长细胞状态的稳定性，细胞存活率高。
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时间：2023-10-12 06:44
将细胞放液氮表面十公分，离罐口20公分，不浸入液面下，盖紧液氮罐盖，液氮温度会不会变化，液氮温度变化和什么有关?液氮的温度跟压力有关，压力大的话温度要高于77k;压力小的的话，反之;这个压力高低相对于常压。液氮在-196°C时，密度为0.8083g/cm3,那当压力为25MPa,温度为20°时的液氮的密度为，液氮都是无色无味的，液氮的好坏可能取决于别人是否用液态空气充当液氦，液氦的温度比液氮高点。
热心网友
时间：2023-10-12 06:44
