基因探针是 单链DNA吗
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发布时间：2022-04-23 13:09
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时间：2022-05-07 03:49
基因探针（probe）就是一段与目的基因或DNA互补的特异核苷酸序列，它可以包括整个基因，也可以仅仅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之转录而来的RNA。
1．探针的来源 DNA探针根据其来源有3种：一种来自基因组中有关的基因本身，称为基因组探针（genomic probe）；另一种是从相应的基因转录获得了mRNA，再通过逆转录得到的探针，称为cDNa 探针（cDNa probe）。与基因组探针不同的是，cDNA探针不含有内含子序列。此外，还可在体外人工合成碱基数不多的与基因序列互补的DN*段，称为寡核苷酸探针。
2．探针的制备 进行分子突变需要大量的探针拷贝，后者一般是通过分子克隆（molecular cloning）获得的。克隆是指用无性繁殖方法获得同一个体、细胞或分子的大量复制品。当制备基因组DNA探针进，应先制备基因组文库，即把基因组 DNA打断，或用*性酶作不完全水解，得到许多大小不等的随机片段，将这些片段体外重组到运载体（噬菌体、质粒等）中去，再将后者转染适当的宿主细胞如大肠肝菌，这时在固体培养基上可以得到许多携带有不同DN*段的克隆噬菌斑，通过原位杂交，从中可筛出含有目的基因片段的克隆，然后通过细胞扩增，制备出大量的探针。
为了制备cDNA 探针，首先需分离纯化相应mRNA，这从含有大量mRNA的组织、细胞中比较容易做到，如从造血细胞中制备α或β珠蛋白mRNA。有了mRNA作模板后，在逆转录酶的作用下，就可以合成与之互补的DNA(即cDNA)，cDNA与待测基因的编码区有完全相同的碱基顺序，但内含子已在加工过程中切除。
寡核苷酸探针是人工合成的，与已知基因DNA互补的，长度可从十几到几十个核苷酸的片段。如仅知蛋白质的氨基酸顺序量，也可以按氨基酸的密码推导出核苷酸序列，并用化学方法合成。
3.探针的标记为了确定探针是否与相应的基因组DNA杂交，有必要对探针加以标记，以便在结合部位获得可识别的信号,通常采用放射性同位素32P标记探针的某种核苷酸α 磷酸基。但近年来已发展了一些用非同位素如生物素、地高辛配体等作为标记物的方法。但都不及同位素敏感。非同位素标记的优点是保存时间较长,而且避免了同位素的污染。最常用的探针标记法是缺口平移法(nick translation)。首先用适当浓度的DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）在探针DNA双链上造成缺口，然后再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa poly merasⅠ）的5’→3’的外切酶活性，切去带有5’磷酸的核苷酸；同时又利用该酶的5’→3’聚酶活性，使32P标记的互补核苷酸补入缺口，DNA聚合酶Ⅰ的这两种活性的交替作用，使缺口不断向3’的方向移动，同时DNA链上的核苷酸不断为32P标记的核苷酸所取代。
探针的标记也可以采用随机引物法，即向变性的探针溶液加入6个核苷酸的随机DNA小片段，作为引物，当后者与单链DNA互补结合后，按碱基互补原则不断在其3’OH端添加同位素标记的单核苷酸，这样也可以获得比放射性很高的DNA探针。
热心网友
时间：2022-05-07 05:07
基
探针（probe）
段与目
基
或DNA互补
特异核苷酸序列
包括整
基
仅仅
/基
部
；
DNA本身
由
转录
RNA
1．探针
源
DNA探针根据其
源
3种：
种
自基
组
关
基
本身
称
基
组探针（genomic
probe）；另
种
相应
基
转录获
mRNA
再通
逆转录
探针
称
cDNa
探针（cDNa
probe）
与基
组探针
同
cDNA探针
含
内含
序列
外
体外
工合
碱基数
与基
序列互补
DN*段
称
寡核苷酸探针
2．探针
制备
进行
突变需要
量
探针拷贝
者
般
通
克隆（molecular
cloning）获
克隆
指用
性繁殖
获
同
体、细胞或
量复制品
制备基
组DNA探针进
应先制备基
组文库
即
基
组
DNA打断
或用*性酶作
完全水解
许
等
随机片段
些片段体外重组
运载体（噬菌体、质粒等）
再
者转染适
宿主细胞
肠肝菌
固体培养基
许
携带
同DN*段
克隆噬菌斑
通
原位杂交
筛
含
目
基
片段
克隆
通
细胞扩增
制备
量
探针
制备cDNA
探针
首先需
离纯化相应mRNA
含
量mRNA
组织、细胞
比较容易做
造血细胞
制备α或β珠蛋白mRNA
mRNA作模板
逆转录酶
作用
合
与
互补
DNA(即cDNA)
cDNA与待测基
编码区
完全相同
碱基顺序
内含
已
加工
程
切除
寡核苷酸探针
工合
与已知基
DNA互补
度
十几
几十
核苷酸
片段
仅知蛋白质
氨基酸顺序量
按氨基酸
密码推导
核苷酸序列
并用化
合
3.探针
标记
确定探针
否与相应
基
组DNA杂交
必要
探针加
标记
便
结合部位获
识别
信号,通
采用放射性同位素32P标记探针
某种核苷酸α
磷酸基
近
已发展
些用非同位素
物素、
高辛配体等作
标记物
都
及同位素敏
非同位素标记
优点
保存
间较
,
且避免
同位素
污染
用
探针标记
缺口平移
(nick
translation)
首先用适
浓度
DNA酶Ⅰ（DNAseⅠ）
探针DNA双链
造
缺口
再借助于DNA聚合酶Ⅰ（DNa
poly
merasⅠ）
5’→3’
外切酶
性
切
带
5’磷酸
核苷酸；同
利用该酶
5’→3’聚酶
性
使32P标记
互补核苷酸补入缺口
DNA聚合酶Ⅰ
两种
性
交替作用
使缺口
断向3’
向移
同
DNA链
核苷酸
断
32P标记
核苷酸所取代
探针
标记
采用随机引物
即向变性
探针溶液加入6
核苷酸
随机DNA
片段
作
引物
者与单链DNA互补结合
按碱基互补原则
断
其3’OH端添加同位素标记
单核苷酸
获
比放射性
高
DNA探针
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时间：2022-05-07 06:42
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时间：2022-05-07 08:33
