双标准曲线是什么意思

发布网友发布时间：2023-05-18 10:16

共1个回答

热心网友时间：2023-09-29 23:10

所谓相对定量是指在测定目的基因的同时测定某一内源性管家基因，该管家基因的作用有（1）用于核苷酸的拷贝数的比较；（2）作为内源性对照补偿待测样本的体积变异、核酸抽提过程中造成的目的基因变异，以及反映反应体系内是否存在PCR扩增的影响因素；（3）标准化标本。由于管家基因在各种组织中是恒定表达的，所以可以以管家基因的定量来作为某种标准以比较样本来源不同的目的基因表达量的差异。通常选用的管家基因有GAPDH 、β-actin、β2-微球蛋白和rRNA，研究者也可以根据具体的需要而选定合适的管家基因。使用的相对定量较为早期的方法是用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和管家基因的量，再将目的基因的同管家基因的比值作为定量的最后结果。这一方法要求外参、目的基因和管家基因的扩增效率一致。

标准曲线方法使用标准 RNA 样品，标准曲线通过梯度稀释制备，用来对目的基因和看家基因进行分析，结果数据被用来生成标准曲线和线性方程。看家基因的标准曲线由其 C t 值对 RNA 的量做图（ Figure 2A ）。而目的基因的标准曲线由其 C t 值对任意的表达倍数做图。要计算未知样品的相对表达量，首先通过看家基因的标准曲线求出总 RNA 量。然后目的基因的 C t 被用来计算相对的基因表达。最后，目的基因的表达量由看家基因决定的总 RNA 量来做均一化处理。在解释基因表达数据的时候一定要考虑定量的方法，每种方法都要求一种假设，重要的是要记住这种假设，并清楚改假设会给实验结果带来何种影响。

另一种是用 ΔΔ C t 方法进行相对定量。 ΔΔ Ct 方法使用单一的样品（被称为校正样品）来比较未知样品的目标基因的表达。校正样品在每个板上与未知样品同时分析。校正公式为：

这里 ΔΔ Ct = [ C t GI( 未知样品 )- C t GAPDH( 未知样品 )]- [ C t GI ( 校正样品 ) - C t GAPDH ( 校正样品 )] 。 GI 是目的基因，校正样品是任何被选做代表 1 倍目的基因表达量的样品（如未处理的肌细胞）。

这一公式基于这样一种假设：目的基因的扩增效率与看家基因的扩增效率相同，并且目标基因扩增一倍其 Ct 值减少一个循环。很少会与这一假设完全相符，然而，这种方法的优越性在于，由于无需在每个板上对靶基因进行标准曲线分析使样品的通量得以增加，并且这一方法更有益于检测基因表达的诱导或下调。

ΔΔ Ct 和标准曲线的比较列在 Fig. 2 中。所用细胞为 0.1 nM ET-1 处理的细胞或未处理的细胞。制备 Poly(A) mRNA ，使用实时 RT–PCR 对 Poly(A) mRNA 进行分析。正如所示，尽管这个例子并不完全符合 ΔΔ Ct 方法的假设，但所有的方法都给出了相似的结果。通过 ΔΔ Ct 方法得到的 ET-1 处理后 ANF 表达增加的倍数为 4.5 倍，而使用标准曲线法得到的结果为增加 3.0 倍（ Fig. 2C ）。通过对每个重复样本的分析表明每种方法都产生了可重复的结果 (Fig. 2 。再次值得一提的是，重复样本代表的是不同的细胞孔，变化包括了生物差异性、 RNA 得率和实时 RT–PCR 的差异。标准曲线法和 ΔΔ Ct 法都依靠与在每一个后续实验中都再次运行的校正样品的进行比较。 . 增加每一个样品的重复样本将增加数据的精确性，但如果不符合 ΔΔ Ct 方法的假设就不会提高定量的精确性。

模板定量有两种策略；相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。

标准曲线的法的相对定量由于在此方法中量的表达是相对于某个参照物的量而言的，因此相对定量的标准曲线就比较容易制备，对于所用的标准品只要知道其相对稀释度即可。在整个实验中样本的靶序列的量来自于标准曲线，最终必须除以参照物的量，即参照物是1*的样本，其它的样本为参照物量的n倍。在实验中为了标准化加入反应体系的RNA或DNA的量，往往在反应中同时扩增一内源控制物，如在基因表达研究中，内源控制物常为一些管家基因（如beta-actin,3-磷酸甘油醛脱氢酶GAPDH等）。

在实时定量 PCR 技术中，每个模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中纵坐标代表起始拷贝数的对数，横坐标代表 Ct 值。因此，只要获得未知样品的 Ct 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。这是实时定量 PCR 技术的基本原理。

模板的 Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系这一点可以通过严格的数学推导来证明：

X n =X 0 (1+Ex) n (1)

这里 X n 表示第 n 个循环后扩增产物的量

X 0 表示初始模板量

n 表示循环数

Ex 表示扩增效率，对于特定的扩增反应， Ex 为常数

在扩增产物达到阈值线时：

X Ct =X 0 (1+Ex) Ct =N (2)

其中， X Ct : 荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量。在阈值线设定以后，它就是一个常数，我们设为 N 。

方程式 (2) 两边同时取对数得：

lg N=lg X 0 (1+Ex) Ct (3)

整理方程式 (3) 得：

lg X 0 = - lg(1+Ex) × Ct+ lg N (4)

因为 Ex ， lgN 都为常数 , 所以我们说初始模板的对数值与 Ct 值成线性关系。在我们实际应用中，如果做了定量标准样品，软件会给出一个标准曲线，以及标准曲线公式： y=Ax+B. 其中 A 就是公式 (4) 中的

• lg(1+Ex), 即 A= - lg(1+Ex) (5)

这样，我们就可以从 A 值计算出 PCR 反应的扩增效率：

Ex=10 -A - 1

如果 A= -0.301 ，代入公式可得： Ex=1 ，即扩增效率为 100%.

如果 A= -0.201 ，代入公式可得： Ex=0.589 ，即扩增效率为 58.9%.

这样我们就可以判断是否需要优化反应条件。

另外我们还可以看出定量标准曲线在： y 轴上的截距 B=lg N , B 值与阈值设定直接相关。