细胞中纯化得到一种新的未知蛋白因子，如何研究其在细胞中的生物学功能
发布网友
发布时间：2022-04-30 11:07
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热心网友
时间：2023-10-22 21:16
这个问题很麻烦，因为要尽可能详细。。
我尝试一下吧，我只说大概思路，有些地方你可以根据自己的需要不断充实，：
研究方案可以分为以下几个步骤：1.未知蛋白的鉴定工作；2.由蛋白的氨基酸序列找到对应的基因序列；3.基因敲除，基因沉默和基因超表达。
蛋白测序，一般我们是选择N段测序，测上20aa左右就能判断出这个蛋白的哪个蛋白（提交NCBI对比就出来了），当然如果需要也可以选择全蛋白测序，打个质谱；
由蛋白序列确定基因序列，这个是一定要做的，因为直接在蛋白水平做功能验证是不现实的，必须从基因上进行操作，改变基因序列才能改变细胞内部蛋白序列和结构，然后观察细胞特性发生什么样的改变；
基因序列确定以后我们才可以对这个基因在细胞水平上验证功能，一般是选择敲除，通过同源重组方法将细胞内靶基因敲除掉，即knock out，使细胞确实这个蛋白，这个方法是最常用，最严谨的，一般还要搭配敲除之后的恢复，就是基因敲除之后，细胞发生什么样的改变，然后又转进这个基因，恢复蛋白，细胞又恢复到相应的改变，这才算完整验证。其次是基因沉默，也就是knock down，就是通过转染质粒，表达iRNA，在mRNA水平上讲解RNA的量，来实现降低蛋白水平的目的，这是次选方案。最后一个是超表达，在敲除或者自然状态下，在细胞内部高表达这个蛋白。
通过比较不同操作之后的细胞状况，来推定这个蛋白的功能。
~.~累死我了
有问题我们再讨论。
热心网友
时间：2023-10-22 21:17
