cDNA文库的mRNA
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发布时间：2022-04-30 07:38
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时间：2022-06-19 04:53
动物细胞mRNA的制备
植物细胞mRNA的制备 1、mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为溶胞粗制品翻译系统。
无细胞提取物的制备：
用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.
常见的体外无细胞翻译系统:
兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.
缺 点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA 。
麦胚系统用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.
利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA。
优 点：适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.
缺 点：不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.
哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译
*SDS-PAGEanalysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation procts of total mRNA from mammalian cells
2、mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力
3、mRNA分子的大小
哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.
4、总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力
利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA
*Lane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA;
Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII 1)高丰度mRNA
目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA .
2) 低丰度mRNA
目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.
5,mRNA的富集方法
典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.
mRNA的丰度与文库克隆子数的关系
ln(1-P)
N= ln(1-1/n)
N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例
1) 按大小对mRNA进行分级分离
* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.
* 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.
2) cDNA的分级分离
* mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来.
* 优 点:
a)避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解
b)增加了获得全长cDNA克隆的概率
c)获得更准确的分级分离效果(分子量)
3)多聚核糖体免疫学纯化法
* 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo(dT)层析分离mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝. 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法
准备工作：
1.将Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex.,然后置于室温。
2.将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。
3.将OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。
试验步骤：
表3：加入试剂量据此表 Total RNA RNase-free Water to: Buffer OBB
(ul) Oligotex
Suspension (ul) Prep size <=0.25mg 250ul 250ul 15 Mini 0.25-0.5mg 500ul 500ul 30 Midi 0.5-0.75mg 500ul 500ul 45 Midi 0.75-1.00mg 500ul 500ul 55 Midi 1. Total RNA 量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water 补足到500ul
2. 根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension， 轻弹1.5ml离心管彻底混匀
3. 置于70℃水浴中3min
4. 取出置于室温（20℃－30℃）10min
5. 13000rpm室温离心 2min，用移液器吸出上清到一个新的1.5ml离心管中，保留上清直到polyA被结合上。
6. 用移液器取400ul OW2 Buffer混匀沉淀物，将混合物转移到 Spin Column中，RT ，13000rpm，离心1min
7. 将Spin Column 转移到一个新的1.5ml离心管中，加400ul OW2，RT， 13000rpm，离心1min
9. 取出25ul OER Buffer(70℃)到Column中，用移液器吹打3－4次树脂，室温 13000rpm，离心1min。
10. 测OD,并电泳定量。
2.磁珠法分离mRN
1. 在RNase-free的Eppendorf 管中加入0.1~1.0mg的总RNA和RNase-free水至终体积为500ul.
2. 65ºC加热10分钟。
3. 加入3ul生物素标记的Oligo(dT)和13ul20×SSC于RNA中，轻轻混合，室温放置逐渐冷去至室温，一般需10 分钟左右。
4. 同时配0.5×SSC 1.2ml和0.1×SSC 1.4ml.
5. 将磁珠（SA-PMPs）轻晃散开，放入磁性分离架上，使SA-PMPs集中于管的一侧（约30sec），小心去上清，切不可离心。用0.3ml 0.5×ssc漂洗SA-PMPs,用磁性分离架集中磁珠，去除上清，重复3次。
6. 将漂洗后的SA-PMPs重新悬浮于0.1ml 0.5Xssc,注意漂洗后的SA-PMPs应在30分钟内使用。
7. 将（3）中的oligo(dT)/mRNA退火反应物全部加入含漂洗好的SA—PMPs管中，轻轻摇匀，室温下放10 分钟。
8. 用磁性分离架捕获SA-PMPs,小心去上清，但不要弃去。
9. 用0.1×SSC,每次0.3ml洗3次，每次都晃至SA-PMPs悬浮，最后一次漂洗后尽可能多的吸取水相，而不损坏SA-PMPs.
10.将SA-PMPs重新悬浮在0.1ml RNase-free水中，反复颠倒，使SA-PMPs散开，洗脱mRNA。
11.用磁性分离架捕获SA-PMPs,将洗脱的mRNA吸入另一个新的Eppendorf管中。
12.将SA-PMPs再悬浮于0.15ml RNase-free的水中，洗脱，与（11）步洗脱液合并。
13.将得到的mRNA溶液取几微升跑电泳，若mRNA浓度不足以进行下一步的反转录，则需将得到的mRNA溶液浓缩（浓缩步骤见14-18）。
14.加0.1体积的3mol/l NaAc和1.0体积的异丙醇于洗脱液中，-20ºC沉淀过夜。
15.4ºC，13000g离心60 分钟。去上清，加入500ul 70%乙醇混匀。
16.4ºC，7500g离心10 分钟。
17.去上清，真空或空气中自然风干，但不要太干，加适量RNase-free水溶解。
18.重复步骤5-12，将步骤8保留下的样品重新上柱
注意事项：
1．所有操作均需要严格戴手套，戴口罩进行
2．如果total RNA质量高，杂质少，就选择Oligotex的方法分离mRNA，相反则可以用磁珠法。
3．mRNA的电泳图是smear。
