有没有哪种染料加到荧光pcr反应液里不会影响扩增

发布网友发布时间：2022-05-01 05:18

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热心网友时间：2022-06-24 19:56

荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。
|||原理不同：荧光定量pcr实时监测与dna结合的荧光染料激发的荧光；
普通pcr通过检测插入dna中核算染料的量来测定pcr最终产物量，一般是紫外光。
反应要求：荧光定量对扩增片段有较高的要求，一般为100-300bp；
普通定量可以扩增长点的片段。
如果不需要检测产物分子量大小，荧光定量可以不进行电泳就对产物进行定量分析，普通pcr必须电泳。
结果：荧光定量可以实现精确定量，普通pcr则不行。
荧光定量体现可以看到整个扩增过程，可以看到扩增效率，溶解温度，直接得到的标准曲线等，这些是普通pcr无法实现的。
|||这个还真不大清楚|||貌似前者是定量，后者属于半定量。
|||简单的讲PCR技术最早是用于扩增一段特异的PCR片段，用于克隆、测序等实验，后来也将其用于样本中特异的PCR片段有无或非很粗的相对定量，而荧光定量PCR技术则是为了测定样本中特异的PCR片段相对及绝对量，是一种测定特异的PCR片段含量的方式。
如测定病人样本中病原体的含量、实验样本中某一特定的mRNA的含量等。
前些年有人讲过普通PCR后，通过电泳也可以进行定量，其实是将PCR产物的定量与PCR样本中模板定量相混了。
近两年没有人再讲这类了。
|||引物设计是sybr定量PCR法的最大难点，机会好，设计一对引物就能得到很好的结果，机会不好
7、8对引物也出不来，就遇到过这样的问题，在prime5.0上设计了8对引物，符合实验要求的一对也没有，把退火温度提高到了68度也没能把引物二聚体搞定，后来想通了，可能这对引物把其它序列扩增出来了，而且扩增效率很高（一个同学设计了十几对才找到一对好用的）。
记住primer5.0设计出来的100%好的引物，到了定量PCR上不一定好使，这是最大的经验。
定量pCR的引物对匹配度要求不高，现在使用的引物就有几个碱基不匹配，但实验结果很好。
有一个办法可以帮助绕过引物设计这道坎，直接到罗氏网站上专区上找引物。
罗氏网站在线有一个引物设计软件，只要找好目的基因的种属，输入片段序列就可以得到要的引物。
这个软件有很大的好处，他会自动地把种属序列背景扣除，最大限度地去除引物二聚体产生的可以。