病毒鉴定中常用的测试方法有哪些?
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发布时间：2022-04-30 23:22
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时间：2022-06-20 08:23
传染性的测定是病害诊断、病毒鉴定的关键，通常多采用汁液摩擦接种和昆虫传毒测定。
1 汁液接种方法
汁液接种和症状观察始终在防虫温室或网室里进行。取充分表现其症状的幼叶或花茎少许（一般为3～5张叶片）和少量的水（多汁液植物可不加水）一起放进消过毒的研钵里，然后加入0.1mol/L PBS（pH7.0）充分研碎。将600～800目的金刚砂洒在要接种的植物上。用左手托住叶子，右手用脱脂棉小球蘸取病叶汁液或手指沾有病叶汁液，在接种植物的叶片表面轻轻摩擦2～3次。接种完毕，用水将接种叶冲洗。
摩擦强度要适当，既不太重，也不太轻。一般接种叶在大小中等植物的第2～3片叶为宜。测定传毒方式的寄主植物生长不宜过久，苗的大小以真叶3～4片或7～8片时期为好。小苗尽量培养肥嫩些，这样有利于接种成功。一般接种1～2周后出现症状。
较为常用的指示植物有茴藜、苋色藜、普通烟、心叶烟、克利夫兰烟、菜豆、蚕豆、黄瓜、矮牵牛等。
接种成功与否取决于病毒种类、病毒物来源、外界条件、添加剂以及不同的测试植物。另外汁液中病毒的浓度和汁液中是否存在有抑制物质（如单宁、氧化酶等）等与接种成功率有关。在植物不同的生长期有时也会影响接种是否成功，在病毒浓度最高时所取汁液成功率最高。有时以根及花瓣代替叶片也会获得较多的成功。稀释病毒汁液（如1∶10）或加入中性磷酸缓冲液，可以加速清除对病毒的抑制物质。
2 蚜虫接种法
把在野外生长而未感有病毒的植株上的蚜虫连同叶子一起取回室内，将该叶放在健康的小苗上，使蚜虫自行转移到健株上。此苗在温室或饲养笼中培养10～15d，观察小苗是否发病。如果发病，说明此蚜虫带毒，不能作传毒测定。如果该苗不发病，则这种蚜虫大体上说是无毒蚜，可以作传毒接种试验。比较可靠的办法是在早春采来的蚜虫在人工控制情况下给予饲养，不间断观察，将新孵化的蚜虫及时收集起来，在无毒植株上进行饲养。这些蚜虫一般为无毒蚜，因为病毒通过卵传染的种类比较少。如果不放心，还可进行带毒测定。为了防止无毒蚜与其他蚜虫混杂，植株应放在装有尼龙纱的饲养笼中饲养。转移蚜虫时可用软毛的毛笔，将毛笔蘸湿，在蚜虫尾部轻轻触动，待蚜虫停止取食开始爬动时用笔尖转移，防止伤害其口针。
将饲养中的无毒蚜用上述方法转移到病叶上，使它在规定的时间内吸吮病叶汁液（吸毒饲养）。然后将蚜虫转移至健康的指示植物上，使它在一定时间内吸食（传毒饲养）。最后将蚜虫全部除去。对大量持久性病毒蚜虫吸毒饲养的时间一般为1～5min即可（最快的20～30s），对指示植物的传毒饲养，以1～24h为宜。大部分植物病毒为非持久性传毒类型。持久性传毒的蚜虫的吸毒时间应延长至几小时至1d，甚至2～3d，指示植物的传毒饲养也延迟1～2d为宜。
为了避免蚜虫跑掉，可用脱脂棉将植物体接近地面部分的主杆包住，并尽量使脱脂棉起毛。或者把指示植物的盆钵放在贮水器皿*。
3 病毒的提纯
病毒的电镜检查及其他生物学特性的测定都需对病毒进行提纯。病毒提纯是把病毒从寄主细胞中分离出来。分离、提纯、浓缩病毒可以通过物理的实验技术（如差速离心、蔗糖密度梯级离心等）、化学的实验技术（如硫酸铵沉淀、聚乙二醇即PEG沉淀等）、生物化学（如血清学方法）以及其他技术方法。病毒的提纯包括粗提纯和精提纯两个步骤：
粗提纯就是将病毒从植物细胞中与其他细胞成分分离开来。方法如下：将采集的材料，取其含毒最浓的部分，在低温下（-10℃）冰冻，这样不但为机械粉碎增加了方便，同样也使寄主体内非病毒蛋白部分凝固，有利于病毒析出。然后加入一定酸碱度的缓冲液，匀浆。所用缓冲液一般为中性，为磷酸缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液等。为了防止病毒被氧化，常加入一些辅助成分，如0.0lmol/L Na2SO3，0.01mol/L NaEDTA或0.001mol/L MgCl2等。加入有机溶剂能使植物蛋白质变性，病毒分离出来。这样得到的压出液，经过滤及低速离心，弃其沉淀物，留上清液。采用不同转速离心，可将病毒粒体和杂蛋白粒子分开。通常采用差速离心法提纯，即高低速相间，反复多次。高速一般为20000～30000r/min之间，低速一般为6000～8000r/min。离心时间为2h以上才能将病毒粒体沉下来，比病毒颗粒小的杂蛋白粒子和其他小分子杂质随上清液部分弃去。加入适当缓冲液将沉淀洗下来，经低速离心，除去比病毒粒体大的粒子。重复1～2次所得病毒液即为粗提纯液。
精提纯，就是要获得较纯的病毒。粗提纯液仍有少量的寄主球蛋白类等杂质，要除去这种杂质一般用蔗糖密度梯度离心法。就是配备不同浓度的蔗糖液，把高浓度的放在离心管底层，依次把浓度最低的放在顶层，经过层间渗透平衡，形成顶部密度最小，底部密度最大的连续密度梯度蔗糖液柱。然后将部分粗提纯液放在最上层，经过28000～40000r/min的超速离心2h以上，使病毒粒体与其他蛋白质粒子分开，再用差速离心脱去蔗糖，即获得病毒精提纯液。
4 寄主范围的测定
一定的病毒具有特定的寄主范围。对可用汁液接种的病毒（花卉病毒大多属此类）采用前面所描述的汁液摩擦接种法测定其寄主范围。在这些寄主中能找到一种或数种对病毒比较敏感，而且能产生局部枯斑的特殊反应的植物，作为这种病毒的鉴别寄主，如茴藜、苋色藜、黄瓜等某些草本植物是花卉病毒病很好的鉴别寄主。
