有人做CRISPR基因编辑吗
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发布时间：2022-04-26 08:51
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时间：2022-06-26 03:10
ZFN即锌指核糖核酸酶由 DNA 识别域非特异性核酸内切酶构DNA 识别域由系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组（般 3~4 ）每锌指蛋白识别并结合特异三联体碱基锌指蛋白源自转录*家族（transcription factor family）真核物酵母类广泛存形alpha-beta-beta二级结构其alpha螺旋16氨基酸残基决定锌指DNA结合特异性骨架结构保守决定DNA结合特异性氨基酸引入序列改变获新DNA结合特异性锌指蛋白串联起形锌指蛋白组识别段特异碱基序列具强特异性塑性适合用于设计ZFNs与锌指蛋白组相连非特异性核酸内切酶自FokIC端96氨基酸残基组DNA剪切域(Kim et al., 1996)FokI自海床黄杆菌种*性内切酶二聚体状态才酶切性(Kim et al., 1994)每FokI单体与锌指蛋白组相连构ZFN识别特定位点两识别位点相距恰距离（6~8 bp）两单体ZFN相互作用产酶切功能达 DNA 定点剪切目
TALEN
TALENs文名转录激效应物核酸酶TALENs种靶向修饰特异DNA序列酶借助于TAL效应种由植物细菌泌蛋白识别特异性DNA碱基TAL效应设计识别结合所目DNA序列TAL效应附加核酸酶TALENsTAL效应核酸酶与DNA结合并特异位点DNA链进行切割导入新遗传物质相锌指核酸酶(zinc-finger nuclease, ZFN)言TALEN能够靶向更基序列且更容易构建直现直都没种低本且公能够获快速产量TALENs
CRISPR
CRISPR命进化历史细菌病毒进行斗争产免疫武器简单说病毒能自基整合细菌利用细菌细胞工具自基复*务细菌病毒外入侵基清除进化CRISPR系统利用系统细菌声色病毒基自染色体切除细菌特免疫系统微物家10前掌握细菌拥种切除外病毒基免疫功能其比较典型模式依靠复合物该复合物能段RNA指导定向寻找目标DNA序列该序列进行切除许细菌免疫复合物都相复杂其科家掌握种蛋白Cas9操作技术并先种目标细胞DNA进行切除往研究表明通些介入CRISPR能使基组更效产变化或突变效率比TALEN（转录激类受器核酸酶）等其基编辑技术更高近研究发现虽CRISPR许优点类癌细胞系列能产量误伤目标尤其希望改变基做修改
三种系统比较
能疑问既三种系统区别联系呢编特意效性特异性载体性及其四面进行总结
效性
同基位点基靶向性效性都同并且依赖于每种细胞转染效率能点点比较靶向位点细胞系转染比较才意义基于我课题组其课题组ZFNTALENs靶向效率实验我细胞系水平进行比较虽能与同突变特征关Chen课题组近研究进行规模体外析发现TALENs使用与游相关序列候比ZFNs显著具更突变产另组比较TALENsCRISPRs类ESCs细胞情况观察通用CRISPR更换掉TALENs其面条件相同情况通产更基突变克隆本质提高效率近功能重新编码TALENs（reTALENs）已经发展并且类iPSCs细胞基编辑效性相比较于CRISPR提高研究发现CRISPR比reTALENs能够实现7-8倍同源重组效率并且其定程度比HE更效率挡雨ODN捐赠者进行比较
特异性
ZFNTALENs都作二聚体发挥作用其特异性由DNA绑定区域决定区域每剪切位点识别36bpII型CRISPR系统Cas9由种RNA引导核酸特异性由PAMPAM游20引导核苷酸决定表明3’12碱基种序列关键剩8碱基（非种序列）甚至PAM序列都错配ZFN特异性由种带偏见全基组析进行并且发现存频率低检测脱靶事件发其定义高度限部已经研究表明TALENs比ZFN更低细胞毒性脱靶效率
基于研究TALENs诱导CCR5特异性突变CCR5偶基发率17%高度同源CCR2位点1%相反CCR5特异性ZFN性两位点相CCR5位点突变频率14%CCR212%几研究报告CRISPR/Cas系统细胞毒性评价或者DSB诱导检测（即H2AX免疫染色）都没明显脱靶现象近研究发现CRISPR诱导靶向同类细胞基现显著脱靶现象例靶向CCR5CRSIPR/Cas9系统偶CCR2脱靶切除突变率5-20%非接近前讨论CCR5靶向ZFN诱导突变率三其组利用更系统类细胞评估CRISPR脱靶性其结表明CRISPR能能够发目标匹配预测脱靶位点引入微缺失或者插入（插入缺失）外靶向位点定位内涵能够显著影响gRNA识别靶向目标基组序列脱靶序列已经报告说脱靶效应能够通控制Cas9mRNA浓度克服外基编辑候使用配Cas9切口酶已经表明能够显著减少至少1500倍脱靶性
病毒基础传递
ZFN基通慢病毒腺病毒进行传递前ZFNs导入体细胞通共转染两慢病毒载体每载体编码功能性异源二聚体单体相反腺病毒基于HIV慢病毒载体使用与TALEN基传递TALENs尺寸TALE重复序列种应用Cas9较基并且其酶促死版本通慢病毒进行传递虽盛行Cas9稳定表达于细胞毒性依清楚
其面
ZFNsTALENs都能够切割产粘性末端使用标签绑定具互补突部双链寡聚核苷酸（dsODN）进行预测ZFNsTALENs都捐赠质粒基组引入同核酸靶向位点实现ZFNsTALENs通采取同源二聚体式获优势绑定门通设计实现重组（Ob-LiGaRe）种使用质粒倒置两半核酸酶结合位点没改变接区向实现通相同ZFN/TALEN碱基能够阻止连接产物消化CRISPR产非粘性末端直接连接遇挑战近文章表明具Cas9ngRNAs碱基能够诱导具徒步部DSBs并且促进dsODN高效率NHEJ介导插入虽至今没版进入转基DNA能够通引入目标质粒CRISPR/Cas9靶向位点具CRISPR/Cas基组使用CRISPR/Cas系统相比较于ZFNsTALENs具几优势例易于构建花费低并且产物具扩展性并且能够用于靶向基组位点
