DAPI的使用方法
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发布时间：2022-04-25 19:11
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时间：2023-10-13 20:10
在北京地区，银杏花粉的成熟和传粉一般在4月中下旬。该时期内收集北京大学校园内的成熟银杏花粉，2.5%的戊二醛(0.05 mol/L， pH 7.0的磷酸缓冲液配制而成）固定，系列酒精脱水，Technovit 7100 塑料包埋，切片厚度0.5 μm，0.5 g/L DAPI荧光染料染色后，Olympus BH-2落射式荧光显微镜观察，激发光滤光片为UG1(425 nm)，滤激发光片为L420 nm(420 nm)，用Lucky 400胶卷照相。荧光观察后的切片可用考马斯兰染色，可见光下观察照相。按上述方法取不同生长时期的材料置于载玻片上，滴加2.5%的戊二醛(配制方法同上）和0.01 mol/L的DAPI固定并染色，15 min后压片。观察和记录结果方法同上。
1.2 扫描电镜样品制备和观察
收集从小孢子囊中散发出的花粉，采用J.B.Zhang(1990)的方法处理，北京大学电镜室AMRAY1910FE扫描电镜观察。
1.3 花粉的离体培养
1.3.1 培养液的配制
根据对一些裸子植物花粉短期培养的实验条件的探索经验(Pettitt 1985)，培养液中可不必加入大量的补充成分，经多次实验后，最终所采用的培养液的配方为：CaCl2,1×10-3 mol/L;H3BO3,1×10-3 mol/L;为了减少雄配子体中淀粉的荧光，以利于用DAPI染色后观察其中的细胞核，培养液中只加入了0.2 mg/L的蔗糖。最后，用NaOH溶液调pH至5.7～5.9，灭菌后待用。
1.3.2 材料的接种及观察
4月15～25日期间，选用即将开裂的小孢子囊，用70%酒精消毒15～20s，再用1.5%的次氯酸钠消毒30s，剥开其中的花粉接种在盛有3 ml培养液的具盖的称量瓶中，每瓶接种3个小孢子囊中的花粉，黑暗中培养，培养时分别在第12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 时取材，分别用于切片和压片。
2 观察结果
2.1 成熟花粉的形态
银杏4细胞的雄配子体形成后，在小孢子囊中继续发育一段时间，外壁加厚。花粉刚散出时，少数花粉为船形，大部分为近圆球形（图版Ⅰ：1）。光镜下花粉轮廓不太清楚。花粉在空气中或冷储条件下滞留一段时间后变为船形，此时的花粉被认为具有一长线形的萌发沟（图版Ⅰ：2）；在扫描电子显微镜下，圆形花粉有较大的单一萌发区（图版Ⅰ：3），萌发区边缘的外壁呈两个半圆的形状，两个半圆有一定的角度。尚未失水的成熟花粉或吸水后充分膨大的圆形花粉，其两个半圆形的外壁几近相互垂直（图版Ⅰ：3）。除萌发区外，其它部分都有比较均一的纹饰（图版Ⅰ：3，4），这些纹饰主要是条纹，外壁仍然模糊，一如过去和本实验中光镜下的结果。在透射电子显微镜下，外壁上，包括萌发孔处的外壁上，有排列比较浓密的小刺（图版Ⅰ：5～8），同时还可看到，花粉外壁纹理有明显的稀疏差异，致使切面上凸凹不一，个别位置上较为平坦，有的位置上则起伏连绵（图版Ⅰ：5～7）。萌发区边缘的外壁很不规则，所被小刺格外密集（图版Ⅰ：8）。当花粉在空中或-20℃的贮藏条件下停留一段时间后即变为两侧对称的船形（图版Ⅰ：2），船形花粉遇水或足够多的培养液时，在不到1min的时间内即变为图版Ⅰ：1所示的圆球形。
2.2 花粉在贮粉室和离体条件下的萌发
成熟花粉随风传播，由传粉滴协助进入贮粉室中，经过一定时间后，管细胞膨大，并旋转近90°（图版Ⅱ：1），最初长出的花粉管与4细胞的轴向几乎垂直（图版Ⅱ：2，3），花粉管可直接进入珠心细胞中（图版Ⅱ：2），有的还可经过一定的贮粉室空间后进入较远处的珠心细胞间隙（图版Ⅱ：3），花粉管生长过程中可反复分枝，最终形成吸器状结构，管核也在一定的时间内向分枝处移动（图版Ⅱ：2）。
离体培养的结果表明，花粉培养时的早期发育动态与自然条件下并无明显的差异。培养初期的花粉经历了由船形到圆球形的快速转变，管细胞的体积也明显增大（图版Ⅱ：4b），管核与生殖细胞的距离显著增加，仍保持同一轴向（图版Ⅱ：4a），有的开始转向（图版Ⅱ：5）；开始长出花粉管时（图版Ⅱ：6b）管核都有一定角度的转向（图版Ⅱ：6a)，培养3天时，花粉管伸长可达数毫米（图版Ⅱ：7），管核转过近90°，其长轴与原来的4细胞轴向几乎垂直（图版Ⅱ：8）。但有的花粉仅保持图版Ⅱ中4b的形状而不长出花粉管，这些花粉已无活力。
3 讨 论
3.1 关于花粉形态和雄配子体生长过程的重新认识
无论对侏罗纪的银杏类花粉化石还是对生活银杏花粉的研究都表明（Wang et al. 1995， Wang 1990， Xi et al. 1989， Audran 1978， Johnna et al. 1971），尽管时间跨度很大，但所揭示的花粉形态均为两端急尖，两侧对称的船形，形状比较一致。从本文的实验结果看，这一结果的取得是建立在花粉已经适应性地失水，并且巨大萌发区已内陷的基础上。从系统演化的角度考虑，银杏花粉拥有巨大的萌发区比单萌发沟可能更能合理地解释其系统学地位相对较低的事实，因此，本实验的这一结果也是合乎逻辑的。
从实验结果分析，银杏花粉的其他形态很可能是由失水的不同程度所致；花粉从小孢子囊中散出后，花粉形态的转变是对干燥环境的一种适应；花粉早期萌发中所出现的由船形到两侧对称的转变只是花粉吸水后的一种物理现象，可能并不像一种典型的萌发特征（Friedman 1987a，1987b)。另外，从本实验中也可看到，实现从船形到圆球形转变的花粉并不都长出花粉管，表明这一形态转变可能与花粉的萌发和雄配子体的生长过程并无有机的联系。从圆球形—船形—圆球形的转变过程来说，银杏花粉巨大萌发孔的生理意义可能是在最短的时间内失去一定的水或充分吸涨，从而以最快的速度实现对干燥环境的适应或实现从游离花粉到寄生生活雄配子体的转变。
有关银杏花粉外部形态的研究表明，花粉的表面纹饰比较一致，同时，也都肯定了其轮廓不清楚的一方面（Wang et al. 1995， Johnna et al. 1971）。从本实验的情况来看，这一现象很可能是由于花粉的表面密被小刺所致。一方面,这些小刺所产生的毛细管效应阻止了花粉与封片溶液（一般都是水）的充分接触；另一方面，扫描电镜样品制备中的喷金处理也会使这些小刺形成无数折光的小亮点，从而出现图版Ⅰ中图3和4的模糊图像，因而，在分辨率较低的光镜下，或者在扫描电镜的直视下，都很难真正看到其轮廓的边缘。在透射电镜下，以上两种情况均可避免，这样便可看到清楚的具有小刺的花粉外壁图像。
对银杏侧向萌发的初步认识最初是通过离体培养发现的(Friedman 1987a，1987b)，但缺少活体实验的支持，因而无法判断其是否是由偶然因素引起的。本实验除了在离体实验中证实了此现象外，在活体实验中也验证了这一现象的存在，而且，无论是离体还是活体都证实了这一现象的产生是与管细胞内管核的转向密切相关的。同时还看到，离体实验中不能产生花粉管的花粉不发生管核的转向，即这一过程是有活性的雄配子体发育进程中必然存在的阶段。另外，活体萌发中的花粉管可就近进入珠心细胞间隙，也可通过一段贮粉室的空间进入另一侧，说明其伸展方向与其周围的贮粉室环境没有必然的联系，这也表明，管细胞核的转向很可能是与管细胞内部的结构有关。因此，银杏雄配子体的侧向萌发应是银杏的一个典型的生物学特征。
3.2 银杏与苏铁的生殖生物学特性的比较
大量的研究认为（Gifford et al. 1987， Wang et al. 1983a，1983b)，银杏和苏铁由于都具有具鞭毛的游动精子、花粉具单萌发区、雄配子体的基本发育过程类似、花粉管均为吸器状、受精卵*后形成的游离核都较多等生殖生物学的共同特征，而被认为具有相近的亲缘关系。近年来的研究还表明，二者成熟精子释放时都是从近极面的花粉外壁的边缘处（而不是顶端处），这些典型的特征被认为是二者亲缘关系较近的进一步证据（Friedman 1993)。但从本实验和其它一些研究结果(Fu & Yang 1993，Friedman 1993,1987a,1987b）来看，银杏和苏铁的生殖生物学特性也有着较大的差异或者存在有待进一步比较研究的方面，这些主要集中在花粉形态和雄配子体发育等方面。有关雌配子体的资料则相对较少。
3.2.1 花粉形态的差异
银杏和苏铁花粉的形态均为两侧对称的船形，但银杏的为急尖，苏铁的为钝尖(Audran et al. 1978)。过去认为，银杏和苏铁的花粉均为单萌发槽，现在看来，银杏的应为单萌发区，苏铁的则还需进一步实验证实。银杏的成熟花粉为4细胞，苏铁Cycas revoluta的为3细胞，苏铁类的有些类群中有多个原叶细胞。银杏的花粉萌发时经历了船形到圆球形的转变，苏铁的有待进一步研究证实。不过，从银杏花粉的形态和最初的情况来看，苏铁的情况很可能也类似，但需要证实的是，当花粉都成为近圆形时，原来所描述的苏铁和银杏的花粉差异是否会有新的变化。
另外，银杏花粉的传播为严格的风媒，胚珠接受花粉时有受粉滴出现(Singh 1978)；苏铁花粉的传播则有风媒和虫媒两种方式。二者花粉壁的构造(Wang 1990， Xi et al. 1989， Audran 1978)及其纹饰(Audran 1978)也有较大的差异。但目前还无法将这些差异与它们的系统学地位联系起来。
