质粒的构建过程
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发布时间：2022-04-25 21:11
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时间：2022-06-17 13:33
低拷贝数的质粒DNA在宿主细胞*前只能复制1～2次，而多拷贝数质粒可以在细胞*前复制成10～200拷贝。
高拷贝数的质粒称为松弛型质粒(relaxed plasmid)，独立于细菌细胞而自主复制；低拷贝数的质粒一般是严紧型质粒(stringent plasmid)，它们的复制随细菌染色体的复制同步进行。
一般来说，外源基因的表达量随拷贝数的增加而提高，但是当拷贝数很大时，拷贝数与发酵目标产物产率的这种关系却不存在。这主要有两方面的原因：一方面，高拷贝数时外源基因的表达量不再由质粒的拷贝数决定，可能是由转录和翻译水平决定的；另一方面，高拷贝数的质粒往往很不稳定。由于质粒拷贝数的变化直接与基因目标产物的产率有关，因此对于重组蛋白的生产来说，质粒的拷贝数是一个非常重要的参数。
而且同一个细胞里一般不会同时有两种不同的质粒，这是质粒不相容性(plasmid incompatibility)。在细菌细胞增殖过程中，其中必有一种会被逐渐排斥。所以要用纯化过的低拷贝质粒。
低拷贝在鸟*法测序中很常用的。
随机测序战略又称鸟*战略(shotgun strategy),此策略是将人 类基因组DNA用机械方法随机切割成2Kb左右的小片段,把这些DN*段装入适当载体,建 立亚克隆文库,从中随机挑 取克隆片段.最后通过克隆片段的重叠组装确定大片段DNA序列.�
1991年,Hunkapiller T等首先应用鸟*策略分析了小鼠T细胞受体和靶位的94.6kb基因组. 19 95年,美国私立基因组研究所(TIGR)所长Venter JC率先应用鸟*策略对微生物基因组测 序 并取得了成功.同年完成的流感嗜血杆菌的序列测定完全是用shotgun策略直接进行的.该实验充分证明了此策略是分析微 生物基因组全序列的有效策略之一.从1998年起,Venter领导的研究小组对人类全基因组采用鸟* 战 略测序DNA提出大胆构想,计划在三个层次上进行测序,即对每一层次克隆的两端的称为序 列标签联结子(STC)的500bp进行测序.第一个层次用BAC做载体,插入片段为150kb,并计划 构建30万个BAC克隆,对每个BAC两端的500bp直接测序,获得10%的人类基因组序列,平均每 5kb就有一个500bp序列标记.第二层次是用低拷贝质粒作载体,插入10kb片段,构建500万 个克隆,对克隆两端的500bp测序,得到50亿个碱基序列.第三层次是用多拷贝质粒作载体 ,插入2kb片段,计划构建3000万个克隆,再对每个克隆的500个碱基直接测序,可获得300 亿个碱基序列
