显微摄影的反差控制
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发布时间：2022-04-24 06:49
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时间：2022-06-17 04:22
光学显微摄影的反差强一些为好，影响反差的因素有以下五个方面：
标本本身对反差的影响
标本切片厚会产生光的折反射，同时细部结构产生重叠。
标本新鲜、色彩鲜艳反差强。
标本载物片厚或盖片厚、有色、有水纹都会降低反差。
照明对反差的影响： 照明应适中，否则会降低反差，太亮会冲击标本细部结构，太暗会使光路中的脏物呈现在影屏上。
光束直径与视场直径一致时反差强，光束直径大于视场直径就会降低反差。
集光器与虹彩对反差的影响： 集光器过低、虹彩与光栏小，都会降低反差，所以要依具体情况升降集光器或开放虹彩。虹彩光阑的直径必须与物镜口径一致。
滤色片对反差的影响： 用补色滤色片反差强，用统一色滤色片反差弱。
光学显微摄影的反差虽然是大些为好，但也要适当处理，不然反差过大就会损失细部结构， 同时也会影响分辨率，同样不能得到完美的效果。
附：光学显微镜的构造、成像和性能
现代光学显微镜，基于不同用途、种类繁多，如有生物显微镜、金相显微镜，解剖显微镜 等，但基本结构仍为光学和机械两个部分。
单式光学显微镜（通常用的放大镜、解剖镜等）光学结构简单、放大倍数小、光行差明显， 不宜进行显微摄影，在这里就不作介绍了。
复式显微镜光学系统比较完善、机械装置比较复杂，适合于显微工作的开展：
1.显微镜的成像
显微镜的成象光路：
它通过目镜、物镜等光学器件构成放大光路，而使所得虚像A”B“的距离恰好等于人眼的鸣视距离——250毫米，以获得将标本放大10～200倍的可见影像。
2.光学显微镜的基本结构
光学显微镜的基本构造分为两部分。一部分是光学系统，如接目镜、接物镜、聚光器、光源等，另一部分是机械系统，如镜脚、镜臂、镜筒、载物台、物镜转换器、大小螺旋、推进器等。
（1）接物镜
接物镜是光学显微镜的关键部件，整个显微镜系统的成像质量与分辨率都由接物镜决定。它 由一组精密的透镜组成，其作用是将检视标本做第一次放大。显微接物镜生产时做过各种像 差校正，它有一个光阑——孔径光阑，可以控制入射光束的直径，其作用是减小或扩大视场 而不改变像的明亮度。
接物镜有不同倍率其中干燥系用在正常情况下观察。水浸系或油浸系在观察时要 在接物镜口与标本结合处点水或点油。
由于接物镜的成像质量影响摄影效果和观察效果，所以接物镜也是显微摄影的重要组成部分 。
接物镜有三个主要参数——数值孔径N·A值、放大率和盖片厚度。它们都标在镜头壳上。
①N·A值
数值孔径N·A是标志物镜工作性能的重要参数，它决定了物镜的分辨率。N·A=n·sinθ 式中n为介质折射系数，Q为入射角。
表明了物镜数值孔径与介质折射系数、入射角的关系。理论上的最大入射角为180°， 它的一半（90°）的正弦等于1，而空气的折射系数为1.0，水的折射系数为1.33，松节油的折射系数为1.5，所以在同样入射角情况下液浸物镜数值孔径比干燥物镜的大，因此分辨能力也大得多。
N·A值越大，分辨率越大，N·A值越小，景深与焦深越长。
N·A值尚与镜口角有关，镜口角越大，进光量越大，所视像野中的影像越清楚，分辨率就越 大。反之，分辨率就小以致看不清楚。由于低倍物镜的镜口角小于高倍物镜的镜口角， 所以低倍物镜的分辨率就不如高倍物镜的分辨率大。（这是指干燥系而言，油浸系物镜有介 质的折射率，可提高分辨率。
分辨率还受照明强度及光源波长的影响，在一定范围内，照明强度大，分辨力就大。
②放大率
放大率是指检视的放大倍率（即虚像放大倍率），倍率越大，工作距离越近。对每个具体物 镜来讲，它的放大倍率是不变的，工作距离也是不变的。如果采用10×目镜、40×物镜，观 察时放大了400倍，但对显微摄影来讲，由于要增加目镜到 感光片的这段距离就不是400倍了，有些显微摄影的摄影倍率是显微镜放大倍率的1/2。
③对盖片厚度的要求
显微镜对盖片的厚度要求为抽筒的1/100,达0.16～0.17毫米，每差±0.01毫米抽筒则必须相 应改动10毫米，否则其放大倍率就不是标示的倍率了。
油浸镜是借点油的折射率来提高视野的亮度和分辨率。点油后使接物镜 与标本构成一个光具组。
常用于油浸镜的点油及折射率为：
洋杉木油1.51
檀香木油1.51
甘油1.46
树胶1.52
苏合香1.58
折射率越大呈像亮度越强，分辨率也就越大。
（2）接目镜
接目镜主要有以下两个作用一是将物镜送来的初级放大影像再作第二次放大。
二是矫正接物镜成像中的相差、色差和照度。 接目镜的放大率一般从×4～×25，其镜筒长的放大倍率大，反之，放大倍率则小。
眼点是目镜的一个主要参数，在显微摄影中为尤重要。眼点即显微镜对清焦点后在目镜上形 成的出射点。一般眼点距离目镜0.5厘米左右，放大倍率越大，这段距离越短，放大倍率越 小，这段距离越长。目视时，瞳孔恰与此点相接，用带镜 头的照相机摄影时，镜头的前片透镜表面要与此点相接，用不带镜头的摄影装置拍摄时，要 从眼点计算所加近摄装置（伸缩皮腔形式或近摄接圈）的伸长尺寸，以计算实际倍率。
（3）聚光器
显微镜的聚光器有明视野聚光器、暗视野聚光器和特殊用途聚光器（如偏振光、相位差等等 ）。
①明视野聚光器
明视野聚光器由集光器、虹彩、滤色镜环和反射镜四个部分组成。
其中集光镜由两个或两个以上透镜组成，象一个简单的照相机镜头，它的数值孔径（N·A） 值为1.20～1.40左右。它的主要作用是提高象野的亮度和提高接物镜对标本的分辨率。
②虹彩
结构像照相机的光圈，它不但可以调节照明强度，同时还具有改变分辨率和反差的作用，即 ：虹彩开大，分辨力高，反差弱，虹彩缩小则相反。滤色镜环用来放置滤色片或毛玻璃，可 用来改变光色或亮度。
反光镜分为平凹两面，并要使光束正好对准反光镜*。
③暗视野聚光器的视野背景是暗的，被摄体是发光的或明亮的。
暗视野聚光器通常用于拍摄极微小的物体，如化学明胶、梅毒螺旋体或明视野看不见、看不 清没有染色的标本。它也常常用于荧光显微摄影。 使用暗视野聚光器拍摄时光源亮度要强些，不能使用滤色镜。为防止外来光线干扰，暗视野 显微摄影最好在暗室中进行。
3.光学显微镜的主要性能
光学显微镜的主要性能从两方面体现，即放大倍率和分辨率。
（1）放大倍率
理论上讲，光学显微镜的放大倍率在镜筒长度为16～17厘米时为物镜×目镜倍率，但是我们 要 将实物看清，不仅仅是要将其放大，更主要的是分辨出它的细部形态，所以放大倍率要与物 镜、分辨率同时考虑。如，同样是放大200倍的显微镜目镜与物镜，可以有三种组合方式，4 0×5、20×10、10×20，但是三种组合形式的分辨率、焦点深度与成像面的亮度、拍摄时需 要使用的快门速度有很大差别。
物镜 （1） 20×10 （2） 41×5 （3） 10×20
物镜的数值孔经 分辨能力 焦点深度 焦平面亮度比 照相快门速度 0.40 0.70? 1.25? 1.0 1/30秒 0.65 0.43? 0.77? 0.8 1/200秒 0.25 1.1? 2.0? 0.4 1/40秒
在显微摄影中，其放大倍率与出射点至感光片的距离有关，所以显微摄影的放大 倍率的计算公式为M=物镜倍率×目镜倍率×目镜出射点至底片的距离/250毫米。这个公式说 明，只有当目镜出射 点至感光片的距离为250毫米时，显微摄影的放大倍率才等于物镜倍率×目镜倍率，若将目 镜 出射点到感光片的距离加大，其放大倍率也随着加大，但这只是形态增大而分辨率不变。将 底片用来放大照片时也只是形态的放大，而不增加分辨率。
