杂交释放翻译和杂交捕获翻译区别
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发布时间：2023-06-22 18:51
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时间：2024-08-31 15:30
的合成蛋白的能力，含有蛋白质合成所必需的核糖体，tRNA和其他蛋白质合成所必需的分子。然后加入mRNA和必需的20种氨基酸，其中Met是35S标记的。mRNA被转录成放射性蛋白质的混合物，可以通过电泳分离，自显影显示出来。每一条带都代表mRNA所翻译的一种蛋白。
当有cDNA克隆存在时HRT和HART可以非常好的工作。在HRT中，首先将cDNA变性，结合到纤维素膜上或者尼龙膜上，加入mRNA样品，能与cDNA杂交的特异mRNA保留在膜上，除去未结合的分子后，可以收集mRNA并加到细胞外系统中，这样将产生cDNA编码的特异的蛋白质。
HART的不同点在于，HART并不除去未杂交的分子，而是将整个膜转入细胞外系统，杂交的mRNA不能直接翻译，所以除此之外，所有的mRNA都翻译。翻译产物中缺失的蛋白可以进行鉴定。
2. 无细胞翻译系统（Cell-Free Translation System）
实验室中常用的无细胞翻译系统是麦芽胚（germinating wheat seeds）提取物和兔网织红细胞（rabbit reticulocyte cell）提取物，也有使用非洲爪蟾（Xenopus laeuis）卵母细胞体系的[1]。无细胞翻译系统主要含有：
（1）核糖体；
（2）tRNA；
（3）20种氨基酸，其中一种带有放射性标记（实验室中也经常使用35S-甲硫氨酸<35S-methionine>），供放射自显影检测之用；
（4）控制蛋白质合成的相关因子。
无细胞翻译系统主要有如下3点优越性：
（1）在无细胞翻译系统中，蛋白质合成的活性极高。
无细胞翻译系统就是一种人工制造的蛋白质“合成机器”， 其功能就是专门进行蛋白质的合成。相对于传统的宿主菌翻译系统而言，无细胞翻译系统不用考虑宿主菌本身的生活能力，只需大量合成目的蛋白质即可，效率极高[2]；
（2）专一性地翻译目的基因的序列。
与（1）相同，无细胞翻译系统不受到宿主菌的干扰。假设一重组子X，如果加入到无细胞翻译系统中，则该系统只翻译重组子上有限的核酸序列，便于[论文网 lunwen.nangxue.com]对目的基因及其表达产物进行分析。相反，如果将重组子X导入某一受体细胞，则表达产物将包括重组子与宿主细胞两方面的蛋白质，且后者将占绝大多数，给分析工作带来极大的不便；
（3）加入了放射性标记的氨基酸，有利于对翻译产物进行检测；
作为基因工程研究的重要手段，无细胞翻译系统的主要功能就是定向地合成所需蛋白质，并对其进行检测。常在系统的氨基酸底物中添加一种带有放射性标记的氨基酸，或者使用35S-甲硫氨酸（35S-methionine），便于翻译后的检测工作[3]。
3.HRT和HART
HRT和HART的技术思想是相同的，核心内容都是以目的基因的mRNA为操作对象，用放射自显影的方法检测其表达产物的有无，而其中的关键步骤，就是以目的基因为模板，获得该基因的cDNA，在杂交检测中作为探针使用。
在HRT中，目的基因与载体连接之后，将进行如下操作：
（1）将连接后的重组子加入到无细胞翻译系统中，进行转录、表达，提取mRNA；
（2）从提取的mRNA中取出一部分，以目的基因为模板设计引物、以 mRNA为底物进行RT-PCR，获得目的基因的cDNA；
（3）将cDNA固定在*纤维素（nitrocellulose）或尼龙（nylon）膜上，作为杂交探针之用；
（4）将余下的RNA与上述cDNA混合、温育，然后进行非特异性的洗脱，即通过控制洗脱反应的条件，将那些不与cDNA发生特异性杂交的RNA分子洗脱掉；
（5）转变洗脱条件，进行特异性的洗脱；如果有mRNA分子与cDNA发生特异性的结合，则此mRNA将在这一步骤中被洗脱下来，并且此mRNA就是目的基因的转录产物；
（6）收集洗脱产物，加入到无细胞翻译系统中，通过蛋白质电泳和放射自显影（autoradiography）检测表达产物。
显而易见，由于使用了无细胞翻译系统，去除了大量的、与检测实验无关的mRNA分子，所以HRT的实验结果只有两个：
（1）只有一条放射性条带，即目的基因的最终表达产物。此结果表明：目的基因与载体成功连接并转化、能够在宿主菌中顺利
