RT-PCR的原理是什么?有何用途?

发布网友发布时间：2022-04-26 18:00

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热心网友时间：2023-09-19 23:47

原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆转录PCR，是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。

首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组 DNA的污染。

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。

扩展资料

反转录酶的选择

1、Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。

2、禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。

3、Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4、MMLV反转录酶的RNase H突变体：商品名为SuperScript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

参考资料：百度百科——RT -PCR

热心网友时间：2023-09-19 23:47

RT-PCR有两种解释：1，最常用的理解：RT 是‘逆转录’（reverse transcription）的缩写2，现在也有人这么用：RT是‘实时’（real time）的缩写1，先说逆转录PCR：这项技术使用的‘逆转录酶’来自逆转录病毒，是一种能按照碱基互补配对原则，以脱氧核糖核苷酸为底物，以寡居dT为引物，把mRNA转换成相应DNA的酶，由于该酶的效果与中心法则（DNA所承载的生物信息表达顺序应该是DNA-RNA-蛋白）顺序相反，故而有'逆转录'之称。由于逆转录反应使用了引物和模板，也是聚合酶链式扩增的（PCR是‘链式扩增反应’polymerase chain reaction 的缩写）故称为RT-PCR。再说其用途：我们提取的RNA主要是rRNA，即核糖体RNA，但很少有人用它做些什么，倒是含量较少的mRNA，即信使RNA是中心法则所述的遗传信息表现的中转站，所以我们要把微量的信使RNA搞出来，更重要的是，RNA太容易分解了，环境中无处不在的RNA酶啊，以及其容易被水解的特点啊，让你不得不尽快把珍贵的信使RNA转化成稳定的形式，于是就有了RT-PCR。2，再说实时PCR细胞瞬时转录的mRNA种类颇多，各种mRNA含量也有实时的改变，这反映了细胞核内转录因子根据环境要求在做出相应的变化，realtime-PCR，以及quantitative realtime-PCR （简称qRT-PCR）就应运而生。原理：利用PCR高度的特异性，通过特定的引物能在复杂样品中得到的特定序列的DNA，而这种特定DNA的产量跟反应初始阶段模板量是直接相关的。简单说来。经过一个PCR循环，可以把一个模板变成两个，在经过一个循环，就会变成四个，以此类推。如果PCR的检测线是1000个产物，那么当你的初始样品中模板是n个，那就需要经历的循环数为的时候才能检测，这就把循环数与初始样品中模板数联系起来了。也就是说经过计算，达到检测限的循环数就能反映初始RNA样品中某种RNA的含量多少。在实际中，使用了特殊的含有荧光剂的引物，光学检测相应光强度的产物所需的循环数，能高度灵敏的达到目的。realtime-PCR有两种。绝对定量和相对定量。绝对定量常用于逆转录病毒侵染细胞的检测，比如你想知道有多少HIV侵染了样本中的T细胞，你可以收集一定数量的T细胞并提取RNA，通过逆转录，以及taq酶利用HIV的特异引物进行扩增，最终的循环数可以反应你的这群T细胞正在被多少个HIV侵染。相对定量常用于检测实时的转录谱，例如在给药前后，某重要基因转录的实时变化，可以分别收取给药前后的全RNA，用相对转录量不变的基因为内参，如GAPDH或beta-actin，与目标基因转录的转录量对比，来定量反应药物对目的基因转录含量的影响。一气呵成，难免有错，看着玩吧

热心网友时间：2023-09-19 23:48

RT—PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，在DNA聚合酶作用下扩增合成目的片段。RT—PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。BIOG RNA保护剂可有效阻止RNase活性来保护RNA不被降解；保存在RNA保护剂中的RNA样本在-20℃条件可保存六个月，并且加入保护剂的RNA可直接做下游实验，无任何影响。BIOG Super cDNA Synthesis Kit具有超高的灵敏度，最低可检测到1pg总RNA 中的几十个目标RNA分子，反应结果适用于后续的PCR分析、PCR克隆、定量PCR等。

热心网友时间：2023-09-19 23:48

PCR全称多聚酶链式反应，原理是DNA的体外扩增。
具体来说：在EP管里加入DNA、合成原料（dNTP、引物）、耐热的DNA聚合酶（taq）后，放入PCR仪，PCR仪会利用升温使DNA变性，在聚合酶的作用下使单链复制成双链，进而达到基因复制的目的。
用途：
1、核酸的基础研究：基因组克隆
2、不对称PCR制备单链DNA用于DNA测序
3、反向PCR测定未知DNA区域
4、反转录PCR（RT-PCR）用于检测细胞中基因表达水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA
5、荧光定量PCR用于对PCR产物实时监控
6、cDNA末端快速扩增技术
7、检测基因的表达
8、医学应用：检测细菌、病毒类疾病；诊断遗传疾病；诊断肿瘤；应用于法医物证学

热心网友时间：2023-09-19 23:49

RT-PCR较逆转录pcr,有叫反转录pcr，是聚合酶链式反应的一种广泛应用的变形，在RT-PCR中，一条rna链被逆转录成为互补dna，在一次为模板通过pcr进行dna扩增。使用过BIODAI相关的实时荧光定量pcr监测，CT 值的起跳点还是挺早的。在临床上给药监测啥的，都是有很好的用处的。