protocol 分享| 基于 CRISPR/Cas9 系统的动物基因敲除技术
发布网友
发布时间：2024-10-10 10:47
共1个回答
热心网友
时间：2024-11-01 00:07
CRISPR/Cas9系统，广泛存在于细菌和古细菌中，作为天然的免疫防御机制。其中的Cas9蛋白，因其切割DNA的强大能力，被发掘用于基因操作。Cas9是一种内切酶，拥有RuvC和HNH两个活性中心，通过crRNA和tracrRNA的介导，精确识别并切割目标DNA。
实验材料和仪器包括无菌手套、手术钳、PCR仪、测序平台等，以及小鼠、促性腺激素、麻醉剂等生物材料。操作流程涉及Cas9靶位点的选取，PCR扩增、测序确认，确保选择纯合且符合NGG PAM序列要求的靶点。构建gRNA体外转录载体，使用特定的酶切技术和oligo合成，然后连接到pT7-gRNA载体上，经过转化、筛选和测序，得到正确的克隆。
Cas9 mRNA和gRNA的制备是关键步骤，通过体外转录和线性化Cas9载体，以及PCR和体外转录gRNA，确保产物质量。随后，将Cas9 mRNA和gRNA混合，通过显微注射技术导入小鼠受精卵，通过扩增和测序目标基因，鉴定基因编辑的成功。
这个基于CRISPR/Cas9的基因敲除技术，能显著提高效率，让研究人员在2-3个月之内获得大量纯合子，对于动物实验、细胞研究和基因编辑具有重要意义，我们团队欢迎业界进行交流合作。
