protocol 分享|过表达载体的构建
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发布时间：2024-10-02 15:15
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时间：2024-12-02 01:41
过表达载体，将目的基因CDS编码区构建到特定载体中，在宿主细胞中高效表达大量目的蛋白，主要用于基因功能研究和大量目的蛋白制备。构建方法多样，本文介绍同源重组法。
构建原理
使用带*性内切酶位点的PCR引物扩增目标DN*段，同时切割质粒载体，再通过同源重组酶连接载体和扩增片段。
过表达载体用途
用于基因功能研究、大量目的蛋白制备。
所需材料与仪器
目的DN*段、引物、高保真酶、*性核酸内切酶、过表达载体、胶回收试剂盒、同源重组酶、感受态细胞、LB培养基、质粒提取试剂盒、移液*、PCR仪器。
构建步骤
1. 双酶切质粒载体：选择载体上的两个酶切位点，使用对应酶双酶切载体。
2. 琼脂糖凝胶电泳回收线性载体，严格参照说明书操作。
3. 目的DNA两端添加酶切位点：设计引物，以DN*段为模板进行PCR扩增，回收产物。
4. 目的DNA连接至载体：按照比例混合，同源重组酶催化，连接目的片段至载体。
参考克隆反应比例（ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit）：最适载体量=载体碱基对数×0.02ng；最适片段量=插入片段碱基对数×0.04ng。
大肠杆菌转化
(1) 混合感受态细胞、连接反应液，冰浴30分钟。
(2) 热激80秒后冰浴2分钟。
(3) 培养基复苏，37℃，200rpm培养1小时。
(4) 培养基涂布，过夜培养。
(5) 阳性菌液PCR检测，测序比对。
注意事项
选取的酶切位点不应存在于目的基因CDS序列中；引物设计时，载体、插入片段序列与酶切位点方向应正向。
同源重组技术使用时，应根据载体长度和插入片段长度计算用量，以提高效率。
感受态细胞转化操作需在冰上进行，DNA溶液体积不超过细胞体积的10%，并使用灭菌试剂。
常见问题解答
判断双酶切是否成功：电泳检查，酶切后应出现两条条带，符合线性载体大小。
菌液PCR无条带：可能菌液浓度低，建议摇至浑浊；引物错误；存在假阳性。
胶回收载体浓度低：增加反应体系，混合后跑胶回收。
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