师兄您好!请问怎么做绝对定量qpcr?
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发布时间：2024-10-03 20:32
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热心网友
时间：2024-10-04 02:31
人们常认为 qPCR 实验充满了玄机，往往需要付出大量时间和精力却难以获得预期结果。实际上，这往往是因为在一些细枝末节上没有做到位。接下来，我将分享一套关于 qPCR 实验的准备与执行策略，旨在帮助你优化操作，减少实验失败的风险。
首先，让我们从实验准备阶段开始。确保你的实验仪器（移液枪与 qPCR 仪）保持良好的校准状态，一般建议每年进行一次校准，以确保数据的准确性。选择适合的引物同样重要，优先选择扩增效率在 90%～110% 的引物，并验证其融解曲线为单峰，以确保高效且特异的扩增效果。
内参的选择与验证同样关键。你可以根据已发表文章的推荐，选择相同物种的内参进行测试。如果找不到合适的内参，选择常见的内参或从内部控制基因库中寻找也是不错的选择。确保你选择的内参在不同样本处理下表达差异不显著，以保证后续实验的稳定性和可靠性。
样品 cDNA 的处理也很重要。理论上，每稀释 10 倍，CT 值会增加 3.3，你可以根据这个规律进行合适的稀释。推荐使用 cDNA 原液、10 倍稀释液、100 倍稀释液等进行梯度稀释，选择 CT 值落在 18~28 范围内的稀释倍数进行定量实验。
接下来，进入实验操作阶段。提前排版与预混，确保准确加样，避免混淆。例如，如果你想比较未处理（对照组）与经处理后（处理组）样本中某基因的表达变化，你需在实验板上进行合理的分组与排板设计。记住，每个处理需做三个复孔，并确保每个孔内的液体体积保持一致。
预混试剂时，使用大体积配置可以增加复孔的重复度，减少误差。对于每个处理组，每孔的加样体积为 10.8 µl（qPCR Mix + 引物）+ 9.2 µl（cDNA 模板）。对于 NTC（无模板阴性对照），每孔的加样体积为 10.8 µl（qPCR Mix + 引物）+ 9.2 µl（ddH2O）。
加样过程中，确保环境的清洁与操作的精确。在配置预混液时，应在超净工作台中进行，避免污染。确保预混试剂在冰上操作，并避免强光直射，以防止模板降解、酶活降低及荧光淬灭。进行加样时，先加大量，后加小量，并注意加样顺序，以减少误差。
最后，确保机器程序的准确性。在诺唯赞 Q712 反应程序、ABI Q3 仪器上进行设置时，要仔细检查管材中无气泡，并避免在管口对准的管盖部分做标记。程序设置包括温度、时间、循环次数等，确保填写正确，并开启荧光采集功能。使用仪器默认的融解曲线采集程序，以确保数据的准确性。
通过以上步骤的严格把控，你可以大幅提高 qPCR 实验的成功率，并获得更加可靠的数据。希望这些经验能够帮助你在实验过程中少走弯路，顺利取得理想的结果。
