技术分享 | 蛋白定量有多难?掌握方法再说话

发布网友 发布时间：2024-09-27 17:15

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热心网友 时间：2024-10-08 01:50

蛋白定量是生物研究中不可或缺的步骤，涉及“总定量”与“个别定量”两种目的。在检测蛋白表达时，需先裂解细胞，确保裂解彻底，或对样品进行实验或标准化保存。进一步判断蛋白表达与产量，需对纯化蛋白进行定量。纯化蛋白进行后续应用如标记前，也需要先定量以计算工作浓度。蛋白结构复杂、种类繁多、功能各异、分子量差异大，目前尚未有理想且通用的蛋白定量方法。常用方法包括紫外分光光度法、双缩脲法、Lowary蛋白定量法、考马斯亮蓝法和BCA法。

紫外分光光度法利用蛋白质中酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸的紫外吸收特性，通过朗伯-比尔定律进行定量。此方法操作简便快速，但需标准品或已知消光系数，且核酸干扰需通过特定公式校正。

双缩脲法基于蛋白质与铜离子形成的络合物颜色深浅与蛋白质浓度成正比，适用于快速定量，但灵敏度较低，对干扰物质敏感。

Lowary蛋白定量法结合双缩脲法和福林酚法，增强肽键显色效果，提高灵敏度，适用于微量蛋白质定量，但植物体内酚类物质和特定去污剂浓度可能影响定量结果。

考马斯亮蓝法使用特定染料与蛋白质结合形成稳定蓝色复合物进行定量，操作简便快速，显色迅速，干扰物质较少，但SDS等去垢剂可能影响显色反应。

BCA法基于蛋白质还原Cu2+形成稳定紫蓝色复合物进行定量，具有高灵敏度、操作简单快速，对大部分化学物质影响小，线性范围广，但受螯合剂和还原剂影响。

以上方法主要针对全蛋白质的“总定量法”，而“个别定量”则采用ELISA、WB和MS等方法。ELISA通过特定抗体结合、标记、检测实现定量，夹心ELISA提高信号放大。WB通过凝胶电泳、转膜、抗体检测实现半定量。MS在定量同时进行定性检测，但需要昂贵仪器*其广泛应用。

综上，蛋白定量方法虽多，但均存在局限，选择方法需考虑实验需求与实验室条件。

热心网友 时间：2024-10-08 01:50

蛋白定量是生物研究中不可或缺的步骤，涉及“总定量”与“个别定量”两种目的。在检测蛋白表达时，需先裂解细胞，确保裂解彻底，或对样品进行实验或标准化保存。进一步判断蛋白表达与产量，需对纯化蛋白进行定量。纯化蛋白进行后续应用如标记前，也需要先定量以计算工作浓度。蛋白结构复杂、种类繁多、功能各异、分子量差异大，目前尚未有理想且通用的蛋白定量方法。常用方法包括紫外分光光度法、双缩脲法、Lowary蛋白定量法、考马斯亮蓝法和BCA法。

紫外分光光度法利用蛋白质中酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸的紫外吸收特性，通过朗伯-比尔定律进行定量。此方法操作简便快速，但需标准品或已知消光系数，且核酸干扰需通过特定公式校正。

双缩脲法基于蛋白质与铜离子形成的络合物颜色深浅与蛋白质浓度成正比，适用于快速定量，但灵敏度较低，对干扰物质敏感。

Lowary蛋白定量法结合双缩脲法和福林酚法，增强肽键显色效果，提高灵敏度，适用于微量蛋白质定量，但植物体内酚类物质和特定去污剂浓度可能影响定量结果。

考马斯亮蓝法使用特定染料与蛋白质结合形成稳定蓝色复合物进行定量，操作简便快速，显色迅速，干扰物质较少，但SDS等去垢剂可能影响显色反应。

BCA法基于蛋白质还原Cu2+形成稳定紫蓝色复合物进行定量，具有高灵敏度、操作简单快速，对大部分化学物质影响小，线性范围广，但受螯合剂和还原剂影响。

以上方法主要针对全蛋白质的“总定量法”，而“个别定量”则采用ELISA、WB和MS等方法。ELISA通过特定抗体结合、标记、检测实现定量，夹心ELISA提高信号放大。WB通过凝胶电泳、转膜、抗体检测实现半定量。MS在定量同时进行定性检测，但需要昂贵仪器*其广泛应用。

综上，蛋白定量方法虽多，但均存在局限，选择方法需考虑实验需求与实验室条件。