如何正确选用内参抗体

发布网友发布时间：2024-09-06 18:09

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热心网友时间：2024-12-05 04:52

免疫印迹（Western blot, WB）作为检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的常用方法，内参的正确选择对于实验结果的准确性至关重要。内参，作为内部参照，一般是指管家基因编码表达的蛋白，它们在各个组织和细胞中的表达相对恒定，被广泛用于检测蛋白表达水平变化的参照。

为何要选用内参？在Western Blotting中，内参用于检测和比较目标蛋白的表达变化。内参的选择应考虑多种因素，包括样本种属来源、目的蛋白的分子量和表达部位。

如何选择内参抗体？首先，需要根据实验样本的物种选择合适的内参。例如，哺乳动物样本通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等作为内参。植物来源样本则可以选择Plant actin、Rubisco等作为内参。选择内参抗体时还需考虑目的蛋白的分子量，通常应确保内参与目的蛋白分子量相差5KD以上。此外，内参的选择还需考虑其在特定环境下的稳定性，如某些情况下GAPDH的表达增高可能不适合作为内参。

常用内参抗体包括β-actin、Tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase等。β-actin、Tubulin和GAPDH作为内参被广泛应用于不同类型的蛋白质检测中。β-actin作为内参广泛应用于细胞浆内蛋白的检测，Tubulin则常用于细胞骨架结构的观察，GAPDH在几乎所有组织中都高水平表达，适用于Western Blotting的内参。

内参的选择需要考虑实验环境和因素，如某些情况下GAPDH的表达可能异常，Lamin等内参在凋亡实验中可能不适合使用。设计实验方案时，应查阅相关文献，考虑内参的稳定性，并在实验过程中关注内参表达的变化。

内参的上样量也是关键因素之一。通常，内参的理想上样量约为5μg，而目标蛋白的上样量则为10-20μg。例如，β-Actin作为内参，其丰度高于细胞中的大多数其他蛋白质，导致其经常超载。在检测低丰度蛋白质时，内参的超载会掩盖蛋白质上样量的差异。因此，正确选择内参抗体及合适的上样量对于确保Western blot实验结果的准确性至关重要。

综上所述，内参的选择及其上样量对于Western blot实验结果的准确性有着重要影响。正确的选择内参抗体并确保合适的上样量，可以监测整个实验体系的正常运行，同时作为目的蛋白上样量和相对表达量的参考。因此，内参的正确选用是实验成功的关键。