多肽固相合成法HPLC分析和纯化

发布网友 发布时间：2024-08-18 21:25

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热心网友 时间：2024-08-25 07:07

在多肽固相合成后的HPLC分析和纯化过程中，关键的步骤是使用高压液相色谱技术。这种技术依赖于柱子和泵系统，它们能够承受高压，允许使用微粒（3-10微米）作为填料。这样，几分钟内，多肽就能得到高度的分析效果。

HPLC主要分为离子交换和反相两种类型。离子交换HPLC基于多肽和固相之间的电荷相互作用，柱子在特定pH范围内带有特定电荷，与带有相反电荷的多肽或混合物发生分离。通过调整pH值、离子强度或两者，多肽可以通过洗脱步骤从柱子上分离，通常先用低离子强度溶液，然后逐渐增加强度。一个例子是使用强阳离子交换柱，如sulfoethylaspartimide在酸性环境中进行分离。

反相HPLC则以疏水作用为基础，多肽通过疏水性连接到柱子上，用降低离子强度的洗脱剂（如增加洗脱剂的疏水性）进行分离。常见的柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，链长通常在G4-G8个碳原子。分离过程中，疏水性越大，使用短链柱子对大疏水肽更有效。尽管如此，离子交换和反相柱在实际应用中区别不大，其他载体如碳水化合物（如苯基）也被广泛使用。

操作过程中，常用的流动相由0.1% TFA-H2O和80% acetonitrile（0.1% TFA-H2O稀释的acetonitrile）组成，以线性梯度混合，速度每分钟0.5%到1.0%。常见的柱子规格为4.6×250mm（3-10μm）和22×250mm（10μm），径向填柱则为8×100（3-10μm）和25×250mm（10μm）。

缓冲剂的选择多种多样，包含如heptafluorobutyric酸、0.1%磷酸、稀He formic酸（pH 2-4）、10-100mM NH4HCO3、醋酸钠/氨、TFA/TEA、磷酸钠或钾、异戊酚等。通过组合这些试剂，形成不同的缓冲剂，但需要注意的是，硅反相柱材料不能长时间暴露于高pH或微碱性环境，以免柱子受损。

在Fmoc-氨基酸的制备和侧链保护阶段，Fmoc基团在二氧六环溶液（含有NaHCO3或Na2CO3）中形成，理想的侧链保护基在碱性条件下稳定，酸性条件下可脱除。

多肽固相合成法——英文解释： solid phase peptide synthesis 简写为SPPS。在肽合成的技术方面取得了突破性进展的是R.Bruce Merrifield，他设计了一种肽的合成途径并定名为固相合成途径。由于R.BruceMerrifield在肽合成方面的贡献，1984年获得了诺贝尔奖。