【小鼠大学问】小鼠基因编辑神器
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发布时间：2024-09-05 09:03
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时间：2024-12-02 06:04
我们是如何实现精准的基因修饰的呢？
今天，我们要探讨的主题是小鼠基因组定点编辑技术。
要做好一件事情，首先要有合适的工具。我们手头确实有几把“刷子”！
让我们逐一介绍，前方将会有大量的实用信息！
ES细胞打靶
在小鼠胚胎干细胞（ES 细胞）中实现DNA同源重组，将其重新注入囊胚腔中，可以形成嵌合胚胎，并在假孕小鼠体内发育，最终形成嵌合体小鼠。这种嵌合小鼠的组织细胞（包括生殖细胞）可以分别来自囊胚的细胞和被注射的ES细胞。因此，通过嵌合小鼠和野生型小鼠的交配，ES 细胞中的遗传信息就能传递给后代小鼠。
利用ES细胞打靶技术建立基因修饰小鼠模型的主要技术路线包括：
（1）构建重组基因载体（正负双向选择系统）
（2）用电穿孔等方法将重组DNA转入受体ES细胞内
（3）用选择培养基筛选抗药ES细胞，并利用PCR或 Southern blot 等方法鉴定发生正确同源重组的ES细胞
（4）将中靶ES细胞注射到受体囊胚中，将注射后存活的胚胎移植到假孕小鼠子宫中，让其受孕，待小鼠出生后，通过观察毛色的嵌合与否和嵌合程度判断是否获得嵌合体小鼠。
CRISPR/Cas9技术
CRISPR/Cas是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统，可用于对抗入侵的病毒及外源DNA。
CRISPR是Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（规律成簇间隔短回文重复）的缩写。CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。Cas则是在CRISPR附近的一个多态性家族基因，这个家族基因编码的蛋白均含有可与核酸发生作用的功能域，并与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas，包括Cas1～Cas10等多种类型。
当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的*下，CRISPR被转录成pre-crRNA，然后被加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。
目前在基因编辑应用中最为广泛的CRISPR/Cas9系统是以Cas9蛋白以及向导RNA（gRNA）为核心组成。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH两个活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用，引起DNA双链断裂。CRISPR/Cas9的剪切位点位于crRNA互补序列下游邻近的PAM区（Protospacer Adjacent Motif）的NGG位点，这种特征的序列在每128bp的随机DNA序列中就重复出现一次。
DNA双链断裂后，在不存在同源模板的情况下发生非同源性末端接合（Non-homologous end joining,NHEJ）修复断裂DNA。通常在Cas9剪切位点附近造成小片段碱基的插入或缺失。如果随机修复发生在基因的编码外显子中，则往往会导致读码框发生移码突变，最终使靶基因无法正常转录翻译。当DNA断裂后，细胞核内同时存在与损伤DNA同源的DN*段，那么则可通过同源介导的双链DNA修复（Homology directed repair ，HDR）在目的位点引入外源DN*段，从而达到片段敲入或编辑的效果。
利用CRISPR/Cas9系统的这些特性，CRISPR/Cas9途径获得基因修饰小鼠模型的主要技术路线包括：
（1）我们可以针对基因组特定序列设计向导RNA（gRNA）
（2）体外转录gRNA以及编码Cas9蛋白的mRNA
（3）将gRNA、Cas9 mRNA注射到小鼠受精卵中
（4）注射后的受精卵移植到假孕母鼠输卵管中，受精卵发育成F0代小鼠。
了解了这两大基因定点编辑利器的工作原理，你可能会问：如果我要做一种基因修饰小鼠，那么到底应该选择哪种技术呢？
且听下回分解！
扩展阅读——正负双向选择系统 (positive-negative-selection, PNS)
由于高等真核细胞内外源DNA与靶细胞DNA序列自然发生同源重组的机率非常低，约为百万分之一，要把基因敲除成功的细胞筛选出来是一件非常困难的工作。因此，需要借助一些筛选标记来解决这一关键问题。
“+” 正筛选标记：通常是药物抗性基因，最常用的就是Neo（新霉素抗性基因）。通过构建打靶载体，将带有目的片段的外源DNA序列连同正筛选基因 neo 通过 DNA 序列间的同源重组替代基因组中需要敲除或修饰的片段，达到敲除或敲入特定基因的目的。正筛选基因 neo的表达赋予重组 ES 细胞具有抵抗细胞毒性药物 G418的特性，使细胞在药物筛选下存活并形成细胞克隆。
“-” 负筛选标记：为减少因随机插入产生的药物抗性克隆对筛选的干扰，可以在打靶载体同源重组区域的外侧加上负筛选基因，通常是细胞毒性相关基因。例如来自疱疹病毒的胸腺嘧啶激酶(TK)基因，该基因可以将对细胞无毒的核苷类似物 Ganc 进行磷酸化，从而产生对细胞有毒的核苷酸类似物。 当打靶载体在细胞内进行同源重组时，TK 基因由于在同源重组区域的外侧，因此不会整合到细胞染色体上，随着细胞的生长和* TK 基因发生自然降解和稀释，从细胞中消失。因此这类细胞不会因为 Ganc 的存在而死。但如果发生打靶载体随机插入整合到 ES 细胞染色体上的情况，那么TK 基因很可能也会同时整合上去，结果导致这类非正确同源重组的ES细胞在 Ganc 的存在下生成有毒的核苷酸类似物而致死。
