手把手教你做CRISPR实验(上)——基因敲除篇

1. 登录 benchling.com/ 创建project 2. 点击CRISPR→ CRISPR guides 3. 输入目标基因，选择最新数据库 4. 选择带有CCDS标识的转录本 5. 复制敲除基因附近序列 选择Exon1进行敲除的原因是能够使基因无法表达，并考虑Clec7a蛋白的翻译起始点。选择合适的gRNA序列，确保MIT和CFD评分高、不匹配其他基因Exon...

Duolink PLA技术可通过同一个实验即可完成对蛋白质互作及其修饰的检测、定量以及确定细胞定位等。Duolink基于原位PLA技术（即邻位连接分析技术），可以帮助您在内源蛋白质表达过程中进行该分析。

CRISPR/Cas9基因敲除技术详解 CRISPR/Cas9系统，广泛存在于细菌和古细菌中，作为天然的免疫防御机制。其中的Cas9蛋白，因其切割DNA的强大能力，被发掘用于基因操作。Cas9是一种内切酶，拥有RuvC和HNH两个活性中心，通过crRNA和tracrRNA的介导，精确识别并切割目标DNA。实验材料和仪器包括无菌手套、手术钳、PCR仪...

然后我们再来看CRISPR/Cas基因敲除 CRISPR/Cas9系统中sgRNA(smallguideRNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strandbreak,DSB），机体自身通过非同源重组（non-homologousendjoining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，...

敲除：在外显子上设计gRNA引导cas9切割，造成双链断裂，当缺失的碱基数为3的倍数，修复后可发生移码突变 敲入：gRNA和cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，细胞以外源携带敲入片段的DONOR作为模板进行同源重组修复（HDR），将敲入片段重组到基因组靶点。点突变：gRNA和cas9复合物造成靶位点DNA双链断裂后，...

传统细菌基因敲除基于细菌中广泛存在RecBCD系统，外源DNA片段（主要是自杀质粒）通过电转化或接合方式进入受体菌与基因组同源片段进行重组，实现基因的插入突变与缺失突变。另一种为利用来源于λ噬菌体的重组系统提供的重组酶，实现电转入的DNA片段（PCR产物）与基因组同源片段的替换，该种技术目前仅能在大肠...

先确定目标基因 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1） 然后对目的基因进行背景调查 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工 设计sgRNA及引物 CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（3）sgRNA及引物设计 CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（4）构建...

目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。由于PAM序列结构简单（5’-NGG-3’...

一、设计方案 1.1 基因的基本信息 确认基因的基本信息，包括名称ID号等，一般会在NCBI等查询。1.2 分析基因结构、氨基酸序列等做生物学信息的分析 1.3分析蛋白质的保守结构功能域 通过综合考虑，设计最佳的KO靶点。1.4分析并设计CRISPR，分析其效率及脱靶的情况 一般使用CCTOP，少数物种如没有可...

依靠一个复合物，该复合物能在一段RNA指导下，定向寻找目标DNA序列，然后将该序列进行切除。基因敲除是用含有一定已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，整合至受体细胞基因组中并得到表达的一种外源DNA导入技术。如要基因敲除动物的可以联系苏州赛业，赛业生物已服务全球数万...

CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计 CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后 CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 1 CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 2 CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 3 CRISPR-Cas9基因敲除实验步骤 day 4 这里我不再放详细的实验步骤了，因为我的实验记录本已经详细的记录了实验...