基因编辑-载体构建-同源重组之Gibson法

发布网友发布时间：2024-09-26 19:56

共1个回答

热心网友时间：2024-12-01 08:15

过去十年，科学家们开发了众多克隆替代品，其中Gibson连接法因其优势在实验室广泛应用。这种技术最初由Dr.Daniel及其团队在2009年提出，以高效组装线性DN*段和目标片段插入载体而闻名。

Gibson连接过程涉及几个关键步骤。首先，通过PCR获取末端带有同源区域的DN*段。混合T5核酸外切酶、Phusion聚合酶和Taq连接酶的酶混合物，它们能在50℃下协同工作，无需长时间孵育，仅需1小时，连接产物即可转化至感受态细胞。

具体步骤包括：设计并扩增包含同源序列的引物，扩增DN*段，然后与线性质粒和Gibson组装混合物反应。酶的作用包括消化DN*段形成单链突出末端，引物退火后，DNA聚合酶填充缺口，最后连接酶形成磷酸二酯键完成连接。这个过程成功率高，通常无需大量筛选，整个克隆过程可在5天内完成。

尽管Gibson连接有明显优点，如一次能连接多个片段，无痕连接，对片段重复区域的选择性更高，但也存在*，如片段长度要求、DNA二级结构影响以及引物设计的特异性。它与CRISPR技术结合，能处理复杂克隆任务，如大载体或染色体片段的克隆，避免了PCR难题。

除了Gibson，还有SLIC和CPEC等基于同源重组的克隆方法，以及Golden gate和Gateway等各有特点的载体克隆方式。在选择克隆方法时，应根据具体实验需求考虑Gibson连接等替代技术的优势。