RT -PCR注意事项

发布网友发布时间：2024-09-27 00:03

我来回答

共1个回答

热心网友时间：2024-10-25 07:00

在进行RT-PCR实验时，首要关注的是保护RNA的稳定性。在提取总RNA的过程中，务必谨慎操作，避免mRNA断裂，确保RNA的完整性。

为了确保实验的准确性，阴性对照的设置至关重要。它能帮助排除非特异性扩增的干扰，确保实验结果的可靠性。

内参的选择和使用是为了精确定量目标RNA。常见的内参如G3PD和β-Actin等，它们的作用在于校正RNA定量误差、加样偏差以及可能存在的PCR反应体系扩增效率不一致等影响。在实验设计时，应确保内参的稳定性和准确性。

PCR过程中，避免平台效应的出现非常重要。平台效应受目标基因长度、序列、二级结构以及起始DNA量等因素影响。因此，针对每个目标序列，需要通过单独实验来确定适宜的循环数，以防止扩增效果受这些因素影响。

为了防止DNA污染，实验者需要采取严格措施。例如，使用DNA酶处理RNA样品，确保RNA样本纯净。此外，尽量选择基因的不同外显子作为PCR引物，以消除基因与mRNA的共线性，从而降低污染风险。

扩展资料

RT -PCR即逆转录-聚合酶链反应。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。