重组质粒的连接、转化及筛选
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发布时间：2024-09-30 18:14
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时间：2024-10-06 01:55
质粒连接与转化过程的详述
在分子生物学研究中，质粒作为载体，以其稳定性和操作便捷性，常用于克隆较小的DNA片段，尤其是那些结构简单、大小低于10kb的片段。实现这一目标通常包括三个关键步骤：质粒和目的DNA片段的连接、转化细菌以及筛选重组子。本文将详细阐述这些步骤的执行方法及其背后的原理。
连接反应是整个过程的核心。为实现这一目标，首先需使用限制性内切酶对质粒DNA和目的DNA片段进行切割，生成互补或非互补的粘性末端。粘性末端的连接通常更为高效。通常，质粒载体包含多个限制酶识别序列，允许与目的DNA片段的末端匹配，从而定向克隆。在PCR扩增时，人为添加酶切位点也能促进连接。连接反应中，通过调整外源DNA片段和载体DNA的浓度比例，可以限制载体的自身环化，提高正确的连接产物数量。
转化步骤涉及将重组质粒导入受体细菌，如E.coli DH5α，实现DNA的遗传传递。转化效率的提升可通过加入聚乙二醇（PEG 8000）促进DNA分子凝聚成聚集体。此外，去除载体DNA的5'磷酸基团可最大限度抑制自身环化，使带5'端磷酸的外源DNA片段更易与载体相连，形成一个开环分子，在后续转化过程中，缺口可自动修复。
筛选重组子是确保克隆成功的关键步骤。在筛选过程中，利用遗传学手段如α互补现象进行鉴别。重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α互补现象筛选相结合的方法。由于载体pBS带有Ampr基因，只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活。仅带有自身环化外源片段的转化子则无法存活，这是初步的抗性筛选。pBS还带有lacZ基因的调控序列及β半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。在各自独立情况下，pBS和DH5α编码的β半乳糖苷酶片段均无酶活性。但在融合时，可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整近操纵基因区段的β半乳糖酸阴性突变体之间实现互补，称为α互补。α互补产生的Lac+细菌在含X-gal和IPTG的筛选培养基上形成蓝色菌落，而重组质粒转化子在相同条件下形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α互补Lac+细菌由于含β半乳糖苷酶，能分解乳糖产生乳酸，菌落呈现红色。重组质粒转化子失去α互补能力，无法分解乳糖，菌落为白色。通过这一系列筛选步骤，可将重组质粒与自身环化的载体DNA区分开来。
重组质粒的连接、转化及筛选
转化步骤涉及将重组质粒导入受体细菌，如E.coli DH5α，实现DNA的遗传传递。转化效率的提升可通过加入聚乙二醇（PEG 8000）促进DNA分子凝聚成聚集体。此外，去除载体DNA的5'磷酸基团可最大限度抑制自身环化，使带5'端磷酸的外源DNA片段更易与载体相连，形成一个开环分子，在后续转化过程中，缺口可自动修...
质粒裂解系统
质粒裂解系统是一种高效的生物技术工具，用于从细菌中提取质粒DNA。该系统基于特定的裂解缓冲液和蛋白酶，能够快速、选择性地破坏细菌细胞壁和细胞膜，释放质粒DNA。与传统的煮沸法或碱裂解法相比，质粒裂解系统具有更高的提取效率和纯度，操作简便，节省时间。此外，该系统兼容多种质粒类型，广泛适用于分子生物学实验、基因克隆和表达分析等领域。在生物技术研究和应用中，质粒裂解系统发挥着重要作用。利穗科技（苏州）有限公司于2009年在苏州生物纳米园成立，为国家高新技术企业。目前，利穗拥有45000平米的生产基地及3500平米的应用开发实验中心，员工人数超过450人。利穗是生物制药行业下游纯化设备制造商和工程解决方案提供商，服务超过1000...
论述抗生素筛选重组菌的过程?
1、获取目的基因：用限制性核酸内切酶切割下目的基因。2、基因表达载体的构建：将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。3、将目的基因导入受体细胞：将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。4、目的基因的检测与鉴定：用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生...
质粒连接时,怎么筛选正向连接?
对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。三、 重组质粒的筛选 1、每组连接反应转化原液取100μl用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。2、倒置平板于37℃继续培养12-16...
做重组质粒时,转化提质粒后PCR验证为阳性,但是酶切却切不出来!_百度知 ...
PCR非常灵敏，你做连接的时候连接产物就是目的片段和载体，转化的时候连接产物混到感受态细胞里，涂板的时候，那些没连接进去的目的片段DNA则存在于你的平板上，菌落上自然也有，而挑菌落的时候则把把这些DNA带到了试管或者三角瓶里，提质粒的时候它们因为很短，自然不会被蛋白质细胞器基因组DNA沉淀带走，...
连接和转化的问题
不对就重新做，重新做克隆、转化和筛选重组质粒。不要为那些莫名其妙的克隆花费不必要的时间和精力。最好的办法回收纯化目的片段、载体，再连接转化大肠杆菌，没有必要连接2天，一般4-10C，过夜就可以了。现在有的试剂盒都是37C 5min呢。
dna重组子的筛选鉴定有哪些步骤
以后的操作参照实验一进行。同时做未加CAT片段的空白pQE-31载体质粒连接处理后的感受态细胞转化的对照。实验结果 过夜培养后，实验组和对照组的两个培养皿上都可能会出现一些菌落。如果实验组的菌落数明显多于对照组的菌落，则是好征兆，但实验组中出现的菌落是否含有所需的DNA重组子还须进一步鉴定。
...好载体的DH5α活化提取质粒2.转化至BL21后筛选 ,请问这两步详情步骤...
然后将5 ul质粒加入感受态细胞，放在冰上20分钟。再将其放在42℃恒温槽热激1-2分钟，然后迅速放回冰中静置3-5分钟。之后将感受态细胞加入500 ul SOC培养基中，放入37℃摇床1 h。之后用接种环在含有质粒对应抗性的平板上划线。长出来的单菌落就是含有重组质粒的感受态细胞，如果不放心可以去测个序。
转基因过程分为哪几部分
二、载体构建把这一段目的基因，通过酶连接到一个特定质粒分子上，构成一个插入目的片段的新的质粒分子。三、转化这一步需要用到农杆菌。农杆菌是一类土壤细菌。在它“从良”之前，它经常会侵染植物，让侵染部位细胞大量分裂，形成小疙瘩，我们称为“冠瘿”。利用生物工程手段改造了农杆菌这一区段DNA，...
构建重组质粒之前为什么先连接t载体
先连接T载体是为了提高转化效率一般来说市面上出售的T载体都进行了优化，容易连接片段（也就是效率较高），因此构建表达载体时有时会先连接T载体。同时T载体的测序引物比较明确（商业化的缘故），因此测序也方便一些。更重要的是，T载体往往设计了蓝白斑筛选的功能，插入片段的载体会呈现白色，这样也容易...
实验笔记丨大肠杆菌转化实验(热击法)
荧光原位杂交实验、流式细胞仪样品制备、Southern和Northern blot实验、重组质粒连接、转化及筛选、2D电泳、ChIP实验、Far western blotting实验、圆二色光谱实验、ELISA实验、病毒滴度及生长曲线测定、蛋白质分子对接在线工具、蛋白质序列分析在线工具、DNA定点突变方法、Western Blotting实验中的常见问题及解决...
