RAPD试验注意及解决方法

发布网友发布时间：2024-10-24 09:08

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热心网友时间：2024-10-24 09:44

在进行RAPD试验时，可能会遇到扩增偏差或无扩增的问题。这可能是由于PCR反应中某个组分缺失，需要重复实验以确保所有成分已加入。DNA纯化过程中可能存在的PCR抑制物也可能影响结果，可以通过增加苯酚抽提清洗步骤或稀释DNA溶液来解决。

扩增图呈现异常时，可能由于引物母液失效，此时应重新配制或更换引物。调整退火时间和升温速率，提高Taq聚合酶浓度也是常见解决策略。如果扩增结果条带模糊，可能需更换Taq聚合酶缓冲液或检查引物的有效性，确认酶活性，并调整DNA浓度。

对于高相对分子质量产物弥散分布，降低DNA浓度和Taq聚合酶浓度，减少上样量有助于改善。过高的循环次数可能导致这个问题，应适当减少。同时，确认使用正确的缓冲液制备凝胶，并在较低电压下进行电泳。

若单一带在所有样本中出现，首先要排除引物序列可能是回文结构，这可能导致引物多聚体，此时可以更换不同的引物。带谱无法重复时，可能是DNA浓度问题，控制在10-100ng范围内，避免引物伪迹和错误配对。每个样品进行不同浓度的反应，仅考虑主要条带。

染色后凝胶背景过强影响分辨率，可以通过减少染色时间和延长脱色时间来改善。如果低相对分子质量产物分离不充分，尝试在更高浓度的琼脂糖凝胶或专业纯凝胶上进行分离，或者使用聚丙烯酰胺凝胶。

扩展资料

RAPD 技术是1990 年发明并发展起来的，RAPD是建立在PCR (Polymerase Chain Reaction)基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。其以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列( 通常为10 个碱基对) 为引物，在热稳定的DNA 聚合酶( Taq 酶) 作用下，进行PCR 扩增。扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳分离、溴化乙锭染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。RAPD 技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。