PCR的问题
发布网友
发布时间：2022-05-07 21:44
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热心网友
时间：2022-07-01 14:03
多试几次，相信会成功的
另外有些步骤你参考下，看是不是控制条件上有点问题
1.反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA0.1～2ug
TaqDNA聚合酶2.5u
Mg2+1.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)
2.工作步骤
PCR反应的基本过程
标准的PCR过程分为三步（：
1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，
氢键断裂，形成单链DNA
2.退火（复性）（40℃-65℃）：系统温度降低，引物与
DNA模板结合，形成局部双链。
3.延伸（68℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活
性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′ 端延
伸，合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。追问我用的就是高保真的KOD酶，其实高保真酶不是有非特异条带的概率更大吗。反应条件没问题。
你说的touthdown倒是考虑了，但是这个产量会小吧。
有没有更好的方法啊？
追答暂时也没有想到更好的办法，我也在学习这个，多试验几次试试吧，有时一些经验的获得也要很多次实验的，你在做的过程中也许就会发现更好的方法
