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根据测定结果设计实验对混合物中该蛋白进行分离净化并检测其纯度?

发布网友 发布时间:2022-05-25 00:29

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热心网友 时间:2023-11-18 06:33

在评价样品纯度之前,首先需要鉴定待测杂质的类型,如核酸、碳水化合物、脂质、无关蛋白质、同工酶类、失活蛋白质,进而确定在特定溶液条件中, 能够区分假定杂质和目标蛋白质的理化特性 (化学分析或物理特征)。而纯度则是指待测杂质含量低于某个特定水平。需要注意的是,上述说明中并没有要求描述杂质的性质。纯化过程可能已将某一杂质的浓度降低到检测下限以下,但色谱峰中还有残留。毫无疑问,表观纯度取决于所选择的测定方法及其灵敏度。由于大多数分离方法都能够有效地去除非蛋白质类杂质,因此本章节将主要介绍蛋白质样品中蛋白质类杂质的检测方法。有关核酸、脂类、碳水化合物杂质的检测方法在本系列其他卷中有所介绍。
随着蛋白质类生物制品的流行, 蛋白质纯度已经成为药品管理的重大问题。人用药品注册技术要求国际协调会 (TheInternationalConferenceonHarmonisation,ICH) 关于生物制品的质量指导原则(ICHQ6B,1998) 中考虑到了原料药(基体材料,bulksubstance) 和药物产品 (药物剂型或成品)中的杂质成分, 并认可了生物分子(如蛋白质)的固有异质性 (inherentheterogeneity)。指导原则中阐明:「除了评价原料药和药物产品的纯度可能由预期产品和多种产品相关物质组成——之外,制造商还应评价可能出现的杂质成分。这些杂质可能是过程相关或者产品相关, 它们可能是结构已知的、部分定性的,抑或是未经鉴定的。」该指导原则进一步区分了过程相关的杂质(由生产过程产生,包括宿主细胞蛋白质、宿主细胞 DNA、细胞培养诱导物、抗生素以及其他下游生产过程产生的杂质) 和产品相关杂质,包括生产或储存过程产生的分子变异体(molecularvariant), 这些分子变异体在活性、有效性和安全性等特性上都无法达到预期产品的效果。」该指导原则认可了上述的分析能力。例如,有关原料药指导原则中提到「生物工程制品和生物制品的绝对纯度很难测定,结果往往依赖于所选择的测量方法……因此,通常将多种方法结合来评价原料药的纯度。选择和优化分析过程,应该着重考虑目的产品与产品相关物质以及与杂质的分离。」有关药物产品的讨论类似于原料药,但是还介绍了产品降解以及由于辅料 (excipient) 干扰而造成的产品相关杂质的测定方法。
目前有一些高灵敏度的方法可用于检测样品中的杂质 (表 38.1)。其中每种方法测定分子的一种特定物理特性。方法的选择依赖于以下标准:①可用于检测的蛋白质的量;②待测杂质的性质;③所需的检测精度;④所需的检测灵敏度;⑤可能干扰到该方法的蛋白质及其溶剂特性。最为简单和常用的方法是,经一次或多次分离后证实只有一种组分可被检测到。若纯度标准为只可以存在一种可检测物质,则需用多种分离手段检测杂质。
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