加loading buffer或是加热终止反应，第二天用的话，4度保存即可，今天刚做过

37度。酶切反应需要适宜的温度，都是在37度，如果室温较高，也可以在室温下进行，不过为了确保酶切反应的准确性和稳定性，最好在恒温条件下进行，因此选择37度是比较合适的。

非特异性切割、产物降解、反应终止、反应效率降低。1、酶与非目标DNA序列结合，导致不必要的切割。2、长时间的酶切会导致DNA降解，影响后续实验结果。3、长时间的酶切会导致反应终止，无法完成所需的实验步骤。4、长时间的酶切会导致酶活性降低，从而影响反应效率。

选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间及其体系：酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。纯化问题：纯化PCR产物割胶还是柱式，优选柱式，因为割胶手法不准，很容易割下大块的胶，影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物，...

2.混匀，放370C水浴1-2h。65℃水浴10min，再放4℃冰箱8min终止反应。部分酶切DNA片段用于DNA连接实验，另一部分放4℃冰箱，待琼脂糖凝胶电泳检测。(二)DNA连接实验 T4 DNA 连接酶是一单链多肽，分子量为68,000道尔顿，它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoR...

2. 性酶切与连接</ - 在离心管中混合模板DNA、酶切酶、连接酶、接头、缓冲液，进行过夜反应后，灭酶并保存。3. 预扩增阶段</ - 将连接产物进行PCR扩增，设定参数进行90s的高温预热，然后进行循环扩增，产物再进行电泳检测并稀释，作为选择性扩增的模板。4. 选择性PCR扩增</ - 用EcoR...

终止反应，变性样品，然后就可以电泳了。

但是一旦底物和酶混合，就有可能开始发应，这样子有两个可能问题，一是加样时，如果放在室温，而又不是酶的最佳反应温度，有可能出现非特异性反应，二是加样如果太慢，先加的样比后加的样总反应时间长太多，结果就产生误差．冰降低温度，有可能是暂时抑制酶活性的作用．...

2. 反应进行：将混合液置于37℃水浴中保温2-3小时，让酶切反应充分完成。结束后，加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)终止反应，并冷藏保存。3. DNA分子量标准：利用EcoRⅠ或HindⅢ酶切λDNA，其产物作为电泳标准，λDNA的片段长度分别为23.1kb、9.4kb等。制备方法与上述步骤相同。4. 凝胶准备：...

第一个酶切完成后要回收（可用醇回收，效率比较高）后，再进行第二次酶切。做转化的时候，进行酶连接反应时，注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见，一般连接3小时，16度；对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度，温度过高，会使克隆株无法筛选出来。