加loading buffer或是加热终止反应,第二天用的话,4度保存即可,今天刚做过
37度。酶切反应需要适宜的温度,都是在37度,如果室温较高,也可以在室温下进行,不过为了确保酶切反应的准确性和稳定性,最好在恒温条件下进行,因此选择37度是比较合适的。
非特异性切割、产物降解、反应终止、反应效率降低。1、酶与非目标DNA序列结合,导致不必要的切割。2、长时间的酶切会导致DNA降解,影响后续实验结果。3、长时间的酶切会导致反应终止,无法完成所需的实验步骤。4、长时间的酶切会导致酶活性降低,从而影响反应效率。
选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基。双酶切时间及其体系:酶切过夜,其实完全没有必要,一般酶切3个小时,其实1个小时已经足够。应用大体系,如100微升。纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式,优选柱式,因为割胶手法不准,很容易割下大块的胶,影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物,...
2.混匀,放370C水浴1-2h。65℃水浴10min,再放4℃冰箱8min终止反应。部分酶切DNA片段用于DNA连接实验,另一部分放4℃冰箱,待琼脂糖凝胶电泳检测。(二)DNA连接实验 T4 DNA 连接酶是一单链多肽,分子量为68,000道尔顿,它能催化双链DNA上相邻的3ˊ羟基和5ˊ磷酸末断形成磷酸二脂键。λDNA用EcoR...
2. 性酶切与连接</ - 在离心管中混合模板DNA、酶切酶、连接酶、接头、缓冲液,进行过夜反应后,灭酶并保存。3. 预扩增阶段</ - 将连接产物进行PCR扩增,设定参数进行90s的高温预热,然后进行循环扩增,产物再进行电泳检测并稀释,作为选择性扩增的模板。4. 选择性PCR扩增</ - 用EcoR...
终止反应,变性样品,然后就可以电泳了。
但是一旦底物和酶混合,就有可能开始发应,这样子有两个可能问题,一是加样时,如果放在室温,而又不是酶的最佳反应温度,有可能出现非特异性反应,二是加样如果太慢,先加的样比后加的样总反应时间长太多,结果就产生误差.冰降低温度,有可能是暂时抑制酶活性的作用....
2. 反应进行:将混合液置于37℃水浴中保温2-3小时,让酶切反应充分完成。结束后,加入2μl 0.1mol/L EDTA(pH8.0)终止反应,并冷藏保存。3. DNA分子量标准:利用EcoRⅠ或HindⅢ酶切λDNA,其产物作为电泳标准,λDNA的片段长度分别为23.1kb、9.4kb等。制备方法与上述步骤相同。4. 凝胶准备:...
第一个酶切完成后要回收(可用醇回收,效率比较高)后,再进行第二次酶切。做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解。为保险起见,一般连接3小时,16度;对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来。