解决办法：1、cla1是一个比较不常见的酶，可能酶切体系和ECOR1的缓冲体系不一样，试着分别酶切，就是先切cla1，然后纯化后切ECOR1；或者查找哪个酶的酶切效率高些，那个后切；2、3个小时可能太短了，我一般都是5个小时，或者过夜；3、可能是你菌挑错了，或污染了，重新调菌或者把原来构建成功的质...

连载体PCR扩增出来的是混合物，酶切回收后基本是纯的目的片段，留下的都是载体。

跑胶后找到目的片段,切胶回收,纯化的传统法就是将PCR产物加入2倍体积的乙醇－20度沉淀过夜后低速短暂离心（如 3000rpm离心1~2min),弃掉上清,然后用70%乙醇洗涤一次后,弃掉乙醇,放干后再用无菌水或者TE溶解.当然这种方法对PCR产物纯化后回收率是很低的,你需要多做几管PCR,然后一起纯化回收.但是现在...

首先肯定酶切鉴定目的条带很淡不会影响后续的蛋白表达。表达载体的构建是否成功，酶切鉴定只是第一步鉴定结果，目的条带的深浅有很多影响因素，例如酶切时质粒浓度，插入片段的长短，是否酶切完全等。最重要的是，要将获得的构建质粒送过去测序，如果测序结果正确，这就表明表达质粒构建成功。只要表达质粒构...

楼上说的都基本正确，一般不会连接完直接作酶切。因为连接体系量太少，需要转化扩增，也方便鉴定和保存。如果硬要直接酶切，我觉得肯定会有影响，至少也要抽提一下DNA再做下步反应

单酶切要想防止自连，最好的办法是把载体酶切产物脱磷酸。脱了磷酸的载体就无法自连，它只能和目的片段连接。如果不想脱磷，可以在连接反应体系中加大目的片段的数量，提高阳性克隆的比例，但这不能完全避免自连。不过最好的办法还是做双酶切。单酶切连接实在麻烦。

可以。载体酶切之后不回收也可以进行连接，但是连接效率会受到影响。酶切是分子克隆中常用的技术之一，可以将载体和目的基因切割成特定的片段，以便进行连接。在酶切之后，不回收载体片段，直接进行连接反应，也可以得到连接产物，但是连接效率会降低。

酶发挥作用时，外部环境要有对应的温度，PH，如果外部环境不合适，酶也不能正常发挥作用。

1. 载体自连是常见的现象。载体自连后在非重组缺陷的菌株中往往会发生重组或缺失现象，这会导致你这样的现象。2.污染的外源DNA片段。比如PCR产物中模板、非特异扩增产物等。3 感受态细胞或转化时、或涂布平板时污染了其他带有相同抗性的其他质粒的大肠杆菌。这在实验室也是常见的。特别是一个实验室经常...

不然不太可能自连。我最近在做单酶切载体和片段，但是载体单酶切后没有去磷酸化，T4连接后转化进DH5α，长出很多很密集的菌落，挑了单菌落后摇菌一晚也浑浊了，提质粒后显示质粒浓度特别小，只有30-40 ng/ul，载体本身大小是11k，如果插入了插入片段后，大小是13k。送了一次菌液显示模板浓度小，...